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      急性ITP患兒外周血CD4+CD25+Tr細(xì)胞及其與IL-18的相關(guān)性研究

      2013-12-11 07:04:30雷樹勇陸愛權(quán)陳海云張紹峰黃富登
      關(guān)鍵詞:調(diào)節(jié)性外周血細(xì)胞因子

      雷樹勇 陸愛權(quán) 陳海云 張紹峰 黃富登

      特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)為一種嚴(yán)重疾病,有研究表明ITP患者體內(nèi)存在T淋巴細(xì)胞比例失調(diào),預(yù)示著T細(xì)胞亞群的紊亂參與ITP的發(fā)生發(fā)展過程[1-2]。當(dāng)前ITP發(fā)病機(jī)制的焦點集中于Th1/Th2細(xì)胞之間的失衡,細(xì)胞免疫功能紊亂和細(xì)胞因子與ITP的發(fā)病及臨床進(jìn)展有關(guān),即以Th1漂移為主,IL-18是Thl類細(xì)胞因子,作為細(xì)胞炎性介質(zhì)強(qiáng)有力的誘導(dǎo)者,通過刺激型反應(yīng),誘導(dǎo)嚴(yán)重的免疫紊亂,從而參與一些免疫疾病的發(fā)生發(fā)展,其能否促進(jìn)或抑制Tr細(xì)胞的增殖尚未見報道。本研究對42例AITP患兒外周血中CD4+CD25+Tr細(xì)胞及IL-18水平進(jìn)行了測定,旨在進(jìn)一步探討IL-18和CD4+CD25+Tr細(xì)胞在ITP發(fā)病過程中的作用及可能機(jī)制,為AITP的臨床免疫調(diào)節(jié)治療提供一定的理論依據(jù)和新的治療途徑。

      1 資料與方法

      1.1 一般資料 選擇2009年1月-2010年12月在筆者所在醫(yī)院門診、住院部就診的急性特發(fā)性血小板減少性紫癜患兒42例,其中男18例,女24例,年齡0.5~8歲,平均(5.46±2.25)歲,均符合ITP的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。選取同期在本院體檢科正常兒童42例作為對照組,患兒過往沒有其他疾病病史,其中男16例,女26例,年齡3~9歲,平均(6.14±3.26)歲;兩組年齡、性別等一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

      1.2 研究方法

      1.2.1 外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的檢測 無菌采集ITP患兒及正常健康對照組外周靜脈血5 ml,肝素抗凝,以淋巴細(xì)胞分離液得淋巴細(xì)胞,取分離的T細(xì)胞懸液100 μl,分別加入抗CD4-FITC、抗CD25-PE的單抗各20 μl,同型對照分別為IgGI-F1TC、IgGI-PE,混勻,避光孵育25~30 min。1500 r/min離心5 min,棄上清。加入2 ml PBS洗滌液混勻,1000 r/min離心5 min,棄上清。將細(xì)胞懸浮于0.5 ml PBS洗滌液中,振蕩混勻后上流式細(xì)胞儀檢測。

      1.2.2 細(xì)胞因子IL-18檢測 所有受檢對象清晨空腹抽取靜脈血5 ml,離心5 min,3000 r/min,血清分離后放-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。所有?biāo)本采集前3個月均未接受過成分血小板輸注和任何免疫抑制劑。以酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)定量檢測血清IL-18水平,試劑盒由Biosource公司提供,嚴(yán)格按說明書中的步驟進(jìn)行操作。

      1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,計量資料以(±s)表示,采用t檢驗,并對數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 急性ITP組與對照組外周血Tr細(xì)胞及血清IL-18水平比較 與正常對照組相比,急性ITP患兒外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量及與CD4+細(xì)胞的比例均明顯降低,而血清IL-18水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),見表1。

      表1 急性ITP組與對照組外周Tr細(xì)胞的數(shù)量及血清IL-18水平比較(±s)

      表1 急性ITP組與對照組外周Tr細(xì)胞的數(shù)量及血清IL-18水平比較(±s)

      *P<0.05,△P<0.01,與對照組比較

      組別Tr細(xì)胞(%)CD4+T細(xì)胞(%)Tr細(xì)胞/ CD4+T細(xì)胞IL-18(pg/ml)急性ITP組(n=42)3.11±0.83*27.36±5.11*0.11±0.02*436.05±95.90△對照組(n=42)5.52±0.8337.18±5.480.15±0.03162.82±57.61

      2.2 急性ITP組與對照組外周血Foxp3+Tr細(xì)胞表達(dá)水平比較 急性ITP患兒外周血Foxp3+Tr細(xì)胞與Tr細(xì)胞的比值為(0.42±0.12),對照組外周血Foxp3+Tr細(xì)胞與Tr細(xì)胞的比值為(0.75±0.17),兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

      2.3 急性ITP患兒外周血Tr細(xì)胞表達(dá)與血清IL-18水平的相關(guān)性分析 將Tr細(xì)胞表達(dá)與血清IL-18水平進(jìn)行相關(guān)性分析,如圖1所示,急性ITP組血清IL-18水平越高,外周血Tr細(xì)胞表達(dá)水平均越低,二者呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.821,P<0.01)。

      圖1 外周血Tr細(xì)胞表達(dá)與血清IL-18水平的相關(guān)趨勢圖

      3 討論

      ITP以患者體內(nèi)抗血小板抗體增多,血小板破壞過多而出血為特點,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,可能涉及T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨核細(xì)胞、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子等多因素錯綜復(fù)雜的關(guān)系,尤其是T細(xì)胞免疫在巨核細(xì)胞受抑和血小板破壞中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用[4]。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是近年來發(fā)現(xiàn)的存在于正常人外周血和脾臟中一類特定亞群的CD4+T細(xì)胞,正常人外周血淋巴細(xì)胞中約占5%~10%,具有免疫無能性和免疫抑制性兩大特性的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群,介導(dǎo)的抑制作用非常復(fù)雜,主要通過直接細(xì)胞接觸途徑、分泌抑制性細(xì)胞因子途徑、間接抑制途徑、細(xì)胞溶解途徑、競爭性抑制途徑這五大途徑發(fā)揮抑制功能,能抑制自身反應(yīng)性T、B細(xì)胞的活化和增殖及自身抗體的產(chǎn)生[5]。由于ITP患者存在自身反應(yīng)性T細(xì)胞的異?;罨?,活化的CD4+T效應(yīng)細(xì)胞表面也表達(dá)CD25分子,很難區(qū)分這兩群功能不相同的細(xì)胞,因此,CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)量并不能代表真正的調(diào)節(jié)細(xì)胞水平[6]。Foxp3表面分子是脊椎動物叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子的總稱,特異性表達(dá)在CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞上,是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的一個特異性標(biāo)志。Foxp3表達(dá)在CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的發(fā)育和功能上起重要作用。Walker等[7]研究表明,CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞細(xì)胞的活化可導(dǎo)致CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)Foxp3增加,并與抑制活性有關(guān)。呂學(xué)文等[7]研究發(fā)現(xiàn),ITP者外周血Tr數(shù)量減少,F(xiàn)oxp3 mRNA表達(dá)也減少,提示Foxp3可能通過翻譯水平的改變調(diào)節(jié)Tr細(xì)胞抑制功能。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞主要通過細(xì)胞-細(xì)胞直接接觸作用和細(xì)胞因子發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。IL-18是1996年正式命名的細(xì)胞因子,主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,是一種強(qiáng)有力的免疫調(diào)節(jié)因子,其結(jié)構(gòu)與IL-1相似,功能與IL-12相似,但發(fā)揮作用卻不依賴于兩者。IL-18作為細(xì)胞炎性介質(zhì)的誘導(dǎo)者,通過與其受體結(jié)合,不僅可誘導(dǎo)IL-2及TNF-α等細(xì)胞因子的產(chǎn)生,促進(jìn)Th1類細(xì)胞的增殖、發(fā)育和分化,產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答,而且可通過增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用,直接誘導(dǎo)NK細(xì)胞或T細(xì)胞產(chǎn)生INF-γ,從而誘發(fā)嚴(yán)重的免疫紊亂。故深入研究IL-18在ITP患者中表達(dá)水平的變化,在用于探討ITP發(fā)病機(jī)制及指導(dǎo)其治療中有重要意義。

      本研究發(fā)現(xiàn),ITP患兒外周血Tr細(xì)胞的數(shù)量及CD4+T細(xì)胞中Tr細(xì)胞的比例均明顯低于正常對照組(P<0.05),與芮耀耀等[9]研究結(jié)果相符。表明ITP息兒外周血中Tr細(xì)胞數(shù)量減少,由此可能導(dǎo)致機(jī)體自身有效的免疫抑制功能的減弱,使Thl/Th2平衡向Thl偏移,導(dǎo)致Tr細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步減少,自身反應(yīng)性T細(xì)胞激活增多、凋亡減少,同時促進(jìn)自身反應(yīng)性B細(xì)胞增殖,導(dǎo)致B細(xì)胞產(chǎn)生抗血小板抗體增多,從而促進(jìn)了血小板破壞增加。急性ITP患兒外周血Foxp3+Tr細(xì)胞與Tr細(xì)胞的比值較對照組顯著降低(P<0.05),提示缺乏Foxp 3的功能性表達(dá)可能導(dǎo)致本應(yīng)發(fā)育為Treg的胸腺T細(xì)胞分化為自身反應(yīng)性T細(xì)胞,并逃避陰性選擇,攻擊自身抗原而致自身免疫病,此可能為導(dǎo)致ITP發(fā)病的原因之一[10]。同時筆者的結(jié)果也表明,與正常對照組相比,急性ITP患兒患兒外周血血清IL-18水平明顯升高(P<0.01),與王謙等[11]研究相符。相關(guān)性分析結(jié)果表明,IL-18含量與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)之間呈顯著負(fù)相關(guān),IL-18含量越高,CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)越少,表明血清IL18在ITP發(fā)病機(jī)制上有著重要的作用。IL-18的生物學(xué)功能是通過與淋巴細(xì)胞表面的IL-18受體(IL-18R)的相互作用實現(xiàn)的。表明IL-18通過上調(diào)IL-18R的表達(dá)共同參與了ITP患者Thl型反應(yīng)優(yōu)勢中的病理過程,IL-18與IL-18R結(jié)合后,通過IL-1受體相關(guān)激酶途徑誘導(dǎo)NF-kB的活化,促進(jìn)INF-γ等Th1細(xì)胞相關(guān)因子的釋放,從而加重Thl/Th2細(xì)胞的失衡,IL-18及IL-18R導(dǎo)致Thl細(xì)胞的優(yōu)勢應(yīng)答,可能是ITP發(fā)生的機(jī)制之一[12]。因此,筆者推測可能由于急性ITP患兒外周血中Tr細(xì)胞數(shù)量的減少可能刺激外周血淋巴細(xì)胞IL-18的生成,加劇了Th1/Th2細(xì)胞之間的失衡,導(dǎo)致Tr細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步減少,有效的免疫抑制作用降低,自身反應(yīng)性T細(xì)胞激活增多、凋亡減少,促進(jìn)了血小板的破壞。

      總之,急性ITP患兒外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性性T細(xì)胞數(shù)量減少和II-18水平升高可能在AITP發(fā)病中起重要作用,兩者共同通過加劇Thl/Th2失衡,機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)功能異常從而導(dǎo)致ITP的發(fā)生。

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