白志光

（昆明市東川區(qū)第二人民醫(yī)院 云南 昆明 654100）

人抗乙型肝炎病毒核心抗體（HBcAb）ELISA 試劑盒測(cè)定方法是以抗原和抗體分子為測(cè)定靶標(biāo)的方法，亦是目前最為常用的實(shí)驗(yàn)室診斷方法之一。目前，乙型肝炎已經(jīng)在全球范圍流行，乙型肝炎是由乙肝病毒而引起的一種傳染性疾病，其給患者帶來(lái)的危害十分嚴(yán)重。乙肝病毒，簡(jiǎn)稱HBV，是一種DNA 病毒，在乙型肝炎中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。乙型肝炎病毒核心抗是CTL的主要靶抗原，具有很強(qiáng)的殺傷性，其還有高度的免疫原性，在其內(nèi)部含有免疫抗原表位和豐富的體液，對(duì)細(xì)胞有著很強(qiáng)的免疫反應(yīng)。根據(jù)相關(guān)的臨床研究和文獻(xiàn)資料表明，所有乙型肝炎患者都會(huì)產(chǎn)生HBc，與此同時(shí)，還伴有T 細(xì)胞免疫應(yīng)答，在病毒清除過(guò)程中，這種免疫應(yīng)答非常重要的作用。因此，為了更好認(rèn)識(shí)HBcAg的免疫原特性，加強(qiáng)對(duì)乙型肝炎的預(yù)防、控制與治療，本文主要利用ELISA 方法，使得HBcAg基因片段擴(kuò)增，構(gòu)建含有HBcAg 基因的表達(dá)質(zhì)料與克隆質(zhì)粒，以IPTG 誘導(dǎo)大腸桿菌BL21（DE3）plys中蛋白的重組表達(dá)，并且，采用酶聯(lián)免疫測(cè)定方法檢測(cè)重組蛋白，具體情況如下：

1 資料與方法

1．1 一般資料：購(gòu)自于北京科衛(wèi)臨床診斷試劑有限公司的RCR2．1－TOPO 質(zhì)粒、pHBVNC－l質(zhì)粒（含HBV DNA（adr亞型））、pETl5b、BL21（DE3）PlysS、大腸桿菌DH5a，所有的這些材料都需要由生物制品研究所生物技術(shù)室保存。

1．2 試劑材料：在本組研究項(xiàng)目中，主要用到的試劑材料有：購(gòu)自TaKaRa公 司 的Taq酶、DNA 聚合 酶、T4DNA 連接 酶、IPTG 以 用 限 制 性核酸內(nèi)切酶；購(gòu)自成都天泰生命科技有限公司購(gòu)置的羧芐青霉素（Carb）；塞百盛基因技術(shù)有限公司采購(gòu)的是DNA marker；SEROTEC公司的鼠抗一His tag抗體；在上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司購(gòu)置了質(zhì)粒提取及DNA 回收試劑盒；購(gòu)自于晶美生物工程有限公司的HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG。

1．3 方法與指標(biāo)：采用ELISA 方法，使得HBcAg基因片段擴(kuò)增，構(gòu)建含有HBcAg基因的表達(dá)質(zhì)料與克隆質(zhì)粒，以IPTG 誘導(dǎo)大腸桿菌BL21（DE3）plys中蛋白的重組表達(dá)，并且，采用酶聯(lián)免疫測(cè)定方法檢測(cè)重組蛋白。

1．3．1 設(shè)計(jì)引物與基因擴(kuò)增：在具體操作時(shí)，要根據(jù)HBcAg的基因序列，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，具體如表1所示：

表1

1．3．2 克隆與測(cè)序：在操作時(shí)，將目的基因回收后，根據(jù)DNA 片段的TA 克隆，將基因3的末端加A 處理，再經(jīng)TA 連接后，將其接入到克隆質(zhì)粒中；接著，轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物，在氨芐青霉素和DH5a大腸桿菌的作用下，挑選克隆基因，必須要放在抗性培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，溫度控制在37度，然后轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)液中；在經(jīng)過(guò)擴(kuò)增后，就可以將重組質(zhì)料提取出來(lái)，最后經(jīng)過(guò)EcoRI酶切，進(jìn)行鑒定，具體采用電泳進(jìn)行鑒定，測(cè)序時(shí)交由交賽百盛公司。

1．3．3 質(zhì)粒構(gòu)建 在測(cè)序后，要構(gòu)建含有HBV／C 基因的表達(dá)質(zhì)粒，一般而言，正確的測(cè)序結(jié)果如下：重組質(zhì)粒pCR2．1HBc、NdeI，在經(jīng)過(guò)BamHI酶切后，將目的片段回收，即回收552bp，與此同時(shí)，要經(jīng)過(guò)雙酶切，進(jìn)行亞克隆處理，在pETl5b載體中，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，最后采用電泳，插入目的片段。

1．3．4 鑒定：鑒定主要是針對(duì)HBcAg的表達(dá)及電流進(jìn)行，經(jīng)CaCIz法轉(zhuǎn)化的pETl5b重組質(zhì)粒，從中pETl5b挑選單菌落，并且接種到LB培養(yǎng)液中，其中，要求Carb50μg／mL，最后加入37℃震蕩培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，IPTG 終濃度要求達(dá)1mmol／L，在30℃的溫度誘導(dǎo)2h后，將樣品取出，并且誘導(dǎo)前后的樣品進(jìn)行對(duì)比鑒定。另外，裂解細(xì)菌時(shí)，采用超聲法，上清液收集采用離心法，同時(shí)，要將菌體收集處理，最后，HBcAg 基因與pETl5b載體上的6His基因就會(huì)融合表達(dá)。

2 結(jié)果

在大腸桿菌中，重組HBcAg得到表達(dá)，經(jīng)過(guò)酶聯(lián)免疫測(cè)定方法檢測(cè)，在預(yù)期位置顯示有特異性條帶。因此，采用基因工程的方法對(duì)乙型肝炎病毒核心抗原在大腸桿菌中的構(gòu)建及表達(dá)，成功構(gòu)建了HBcAg原核表達(dá)系統(tǒng)，并獲取重組HBcAg，有效地推進(jìn)了重組蛋白的相關(guān)功能研究，具有很高的研究推廣價(jià)值。

3 討論

乙肝病毒，簡(jiǎn)稱HBV，是一種DNA 病毒，在乙型肝炎中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。乙肝表面抗原（HBsAg）是乙肝病毒的外殼蛋白，本身不具有傳染性，只有抗原性。但它的出現(xiàn)常伴隨乙肝病毒的存在，所以它是已感染乙肝病毒的標(biāo)志。它可存在于患者的血液、唾液、乳汁、汗液、淚水、鼻咽分泌物、精液及陰道分泌物中。在感染乙肝病毒后2～6個(gè)月，當(dāng)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶升高前2～8周時(shí)，可在血清中測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果。急性乙型肝炎患者大部分可在病程早期轉(zhuǎn)陰，慢性乙型肝炎患者該指標(biāo)可持續(xù)陽(yáng)性。目前，乙型肝炎已經(jīng)在全球范圍流行，乙型肝炎是由乙肝病毒而引起的一種傳染性疾病，其給患者帶來(lái)的危害十分嚴(yán)重。乙肝病毒，簡(jiǎn)稱HBV，是一種DNA 病毒，在乙型肝炎中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。

根據(jù)相關(guān)的臨床研究表明，所有乙型肝炎患者都會(huì)產(chǎn)生HBc，同時(shí)還伴有T 細(xì)胞免疫應(yīng)答，在病毒清除過(guò)程中，這種免疫應(yīng)答非常重要的作用。乙型肝炎病毒核心抗是CTL 的主要靶抗原，具有很強(qiáng)的殺傷性，其還有高度的免疫原性，在其內(nèi)部含有免疫抗原表位和豐富的體液，對(duì)細(xì)胞有著很強(qiáng)的免疫反應(yīng)。因此，為了更好認(rèn)識(shí)HBcAg的免疫原特性，加強(qiáng)對(duì)乙型肝炎的預(yù)防、控制與治療，本文主要利用ELISA 方法，使得HBcAg基因片段擴(kuò)增，構(gòu)建含有HBcAg基因的表達(dá)質(zhì)料與克隆質(zhì)粒，以IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌BL21（DE3）plys中蛋白的重組表達(dá)，并且，采用酶聯(lián)免疫測(cè)定方法檢測(cè)重組蛋白。

在操作過(guò)程中，擴(kuò)增所形成的產(chǎn)物，在瓊脂糖凝膠電泳的作用下，將基礎(chǔ)片段回收，從而得到相應(yīng)的目的基因，即552bp。在操作時(shí)，將目的基因回收后，根據(jù)DNA 片段的TA 克隆，將基因3的末端加A 處理，再經(jīng)TA 連接后，將其接入到克隆質(zhì)粒中；接著，轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物，在氨芐青霉素和DH5a大腸桿菌的作用下，挑選克隆基因，必須要放在抗性培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，溫度控制在37度，然后轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)液中；在經(jīng)過(guò)擴(kuò)增后，就可以將重組質(zhì)料提取出來(lái)，最后經(jīng)過(guò)EcoRI酶切，進(jìn)行鑒定。

總之，靶抗原HBsAg是乙型肝炎發(fā)病的關(guān)鍵之所在，同時(shí)，也是患者肝細(xì)胞損傷、HBV 感染慢性化的主要原因，而通過(guò)對(duì)乙型肝炎病毒核心抗原在大腸桿菌中的構(gòu)建及表達(dá)的研究，對(duì)其免疫原特性有了更深的認(rèn)識(shí)，充分提高抗原表達(dá)量，值得進(jìn)一步的探討和研究。

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