李勝云，白 冰，徐振亞

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)院感染管理科鄭州450052

△女，1967年9月生，碩士，副教授，研究方向:腹腔腫瘤術(shù)中腹腔灌注沖洗療法的應(yīng)用，E-mail:lishengyun1@163.com

腹腔轉(zhuǎn)移是胃癌根治術(shù)后最常見的復(fù)發(fā)方式，也是胃癌患者最常見的死因［1］。術(shù)前、術(shù)中或術(shù)后來自腫瘤漿膜層或淋巴結(jié)上腫瘤細(xì)胞的脫落被認(rèn)為是微轉(zhuǎn)移發(fā)生的主要條件［2］。腹腔灌洗療法是腹部外科常用的診療技術(shù)之一，廣泛應(yīng)用于各種腹腔惡性腫瘤術(shù)中，因目前國內(nèi)缺乏統(tǒng)一的較為成熟的標(biāo)準(zhǔn)，所以在臨床操作中較隨意。為此，作者探討持續(xù)腹腔灌洗對不同分期胃癌患者腫瘤切除后腹腔內(nèi)游離胃癌細(xì)胞殘留量的影響，為臨床操作提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 檢測對象 選擇2010年1月至2012年1月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院行胃癌切除術(shù)且病理證實(shí)為腺癌的72例患者為研究對象，參照2011年NCCN 胃癌指南將72例患者按不同胃癌分期分為7組(表1)，分別進(jìn)行術(shù)中腹腔灌洗。該研究經(jīng)鄭州大學(xué)倫理委員會(huì)審批通過并征得患者及家屬簽字同意。

表1 患者一般情況

1.2 腹腔灌洗及標(biāo)本采集 在胃癌切除及完成消化道重建后，立即給予37℃生理鹽水500 mL 灌洗，輕攪動(dòng)后，經(jīng)吸引器將灌洗液抽入負(fù)壓鼓中。每次灌洗后均更換負(fù)壓鼓，取負(fù)壓鼓中的灌洗液送檢，每位患者灌洗6 次，記錄灌洗液中胃癌細(xì)胞數(shù)量為0時(shí)的灌洗次數(shù)，分析同分期患者灌洗液中檢測不到胃癌細(xì)胞時(shí)的最高灌洗次數(shù)。

1.3 腹腔灌洗液的流式細(xì)胞儀檢測 收集每次腹腔灌洗液，2 000 r/min 離心10 min，棄上清，保留沉淀。將沉淀用PBS 稀釋，制成混懸液，取80 μL，加入CD45(BD 公司，貨號(hào)為347464)5 μL 和CEA/CD66(eBioscience 公司，貨號(hào)為17-0668)5 μL 混勻，靜置20 min，加溶血素1 mL，混勻，靜置10 min，1 300 r/min 離心5 min，棄上清，加入PBS 2 mL，再以1 300 r/min 離心5 min，棄上清，加入500 μL PBS混勻，上流式細(xì)胞儀(BD 公司)。以CEA 和CD45為檢測指標(biāo)，以細(xì)胞數(shù)為30 萬設(shè)門，通過流式細(xì)胞儀檢測灌洗液中CD45 陰性且CEA/CD66 陽性的細(xì)胞［CEA(+)CD45(－)］表達(dá)情況，計(jì)算CEA(+)CD45(－)細(xì)胞的百分比。然后，另取100 μL 混懸液滴于載玻片上，在顯微鏡下計(jì)細(xì)胞數(shù)，從而推算出腹腔灌洗液中總細(xì)胞數(shù)，乘以細(xì)胞陽性率，得出腹腔灌洗液中胃癌細(xì)胞總數(shù)。每次檢測均重復(fù)3 次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0 進(jìn)行分析，應(yīng)用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析比較組別效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)的差異，采用Bonferroni 法進(jìn)行組間兩兩比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 胃癌分期和灌洗次數(shù)對灌洗液中胃癌細(xì)胞數(shù)量的影響 見表2。

表2 胃癌分期和灌洗次數(shù)對灌洗液中胃癌細(xì)胞數(shù)量的影響 個(gè)

2.2 最高灌洗次數(shù) 見表3。因?yàn)棰驜、ⅢC 及Ⅳ組患者灌洗至第6 次時(shí)仍可檢測出胃癌細(xì)胞，故不作分析。

表3 不同胃癌分期患者灌洗液中胃癌細(xì)胞數(shù)為零時(shí)的灌洗次數(shù) 灌洗次數(shù)

3 討論

目前腹腔內(nèi)持續(xù)溫?zé)峁嘧⒒?continuous hyperthermic peritoneal perfusion，CHPP)［3-4］被認(rèn)為是安全可靠的治療方案［5］，其理論依據(jù)在于溫?zé)峄煵粌H可改變癌細(xì)胞的通透性，使化療藥物能有效地滲入癌細(xì)胞內(nèi)，充分發(fā)揮其抗癌作用，還能抑制化療后腫瘤細(xì)胞的修復(fù)，增加腫瘤細(xì)胞對抗癌藥的敏感性［6］。該研究改變了CHPP 在密閉通道中循環(huán)灌洗的方式，采用生理鹽水多次大劑量灌洗腹腔，易于在術(shù)中操作，此外，作者認(rèn)為與CHPP 相比，大劑量腹腔灌洗可將脫落于腹腔的腫瘤細(xì)胞塊直接吸出體外，還避免化療藥物及熱效應(yīng)殺傷正常組織細(xì)胞。

該研究按照NCCN 指南分期將患者分為7組，結(jié)果顯示，胃癌分期效應(yīng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨分期進(jìn)展，胃癌細(xì)胞呈增加趨勢，特別是Ⅳ期患者與其余各組的兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一結(jié)果與胃癌分期及胃癌腹腔轉(zhuǎn)移的途徑相符。有研究［7］表明，腫瘤細(xì)胞除了直接從腫瘤組織上脫落至腹腔外，侵及漿膜層的腫瘤細(xì)胞可以穿透及逸出至腹腔，淋巴通道的開放也可使有活性的腫瘤細(xì)胞播散到腹腔，這些播散方式均可使不同分期胃癌患者的腹腔中游離癌細(xì)胞數(shù)量存在差異。

該研究結(jié)果亦顯示，隨灌洗次數(shù)的增多，胃癌細(xì)胞呈現(xiàn)遞減趨勢，這與Marutsuka 等［8］的結(jié)果一致:研究者對63例未侵犯漿膜的進(jìn)展期胃癌患者使用術(shù)中灌洗的方法，發(fā)現(xiàn)連續(xù)6 到8 次用1 L 生理鹽水灌洗腹腔，可使游離癌細(xì)胞數(shù)由(3.8±1.4)×106L－1降為(28±15)L－1，7 到9 次灌洗后腹腔內(nèi)無游離癌細(xì)胞。但對于Ⅰ期患者沖洗1 次，ⅡA 期患者沖洗3 次已基本無游離癌細(xì)胞，這可能與Ⅰ期、ⅡA 期早期胃癌未侵及淋巴結(jié)，術(shù)中脫落細(xì)胞少等原因有關(guān)。該研究還對胃癌細(xì)胞為0 時(shí)所需的灌洗次數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，ⅡA 期患者需灌洗3 次，ⅡA 期以上患者術(shù)中需灌洗至少6 次。

細(xì)胞學(xué)檢查和實(shí)時(shí)定量RT-PCR 是診斷胃癌腹腔內(nèi)播散的常用方法，然而前者敏感率(14%～70%)較低［9］，而后者尚未發(fā)現(xiàn)一種特異的基因片段來診斷胃癌細(xì)胞。CEA 癌胚抗原是消化系統(tǒng)癌變的輔助診斷指標(biāo)，目前多以CEA 作為目的基因檢查腹腔灌洗液，但血細(xì)胞、腹腔的間皮細(xì)胞及手術(shù)操作導(dǎo)致脫落的胃腸道上皮細(xì)胞均有可能表達(dá)CEA［10］，PCR 又是敏感性很高的檢查，出現(xiàn)假陽性的概率高，指標(biāo)的選取和操作的嚴(yán)謹(jǐn)性都嚴(yán)重影響著結(jié)果的準(zhǔn)確性。該研究以CEA 和CD45 為檢測指標(biāo)，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測腹腔灌洗液，同時(shí)具備了高敏感性和高特異性，是理想的檢查手段。流式細(xì)胞術(shù)檢測CEA 在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為86.0%［11］。CD45 是人白細(xì)胞共同抗原，對原始/幼稚細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、有核紅細(xì)胞及細(xì)胞碎片均有不同程度表達(dá)［12］。通過加入CD45-percp，盡可能排除其他細(xì)胞的干擾，故CEA(+)CD45(－)細(xì)胞可被認(rèn)為是胃癌細(xì)胞。

總之，該研究結(jié)果顯示持續(xù)腹腔灌洗可有效減少腹腔內(nèi)游離癌細(xì)胞，ⅡA 期及以上的胃癌患者切除腫瘤后進(jìn)行術(shù)中腹腔灌洗，對預(yù)防游離癌細(xì)胞腹腔轉(zhuǎn)移有確切療效，且符合無傷害原則，操作簡便且安全，醫(yī)療成本較低，不良反應(yīng)少，易于推廣。該文重點(diǎn)匯報(bào)了沖洗次數(shù)對不同分期胃癌患者腹腔游離癌細(xì)胞數(shù)量的影響，課題的后續(xù)研究將繼續(xù)從沖洗液溫度、沖洗量、沖洗時(shí)機(jī)等不同角度開展臨床實(shí)驗(yàn)，以期得到客觀有據(jù)的腹腔灌注沖洗方案，便于臨床應(yīng)用。

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