盧雪梅， 黃演婷， 汪 潔， 金小寶， 朱家勇

(1. 廣東藥學(xué)院藥用生物活性物質(zhì)研究所,廣州 510006; 2. 廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510006)

基因工程菌株的遺傳穩(wěn)定性主要是指工程菌株的質(zhì)粒穩(wěn)定性，即宿主細(xì)胞在繁殖分裂過(guò)程中質(zhì)粒丟失的程度[1]。工程菌的遺傳穩(wěn)定性對(duì)于大規(guī)模發(fā)酵和產(chǎn)物制備至關(guān)重要，是高水平發(fā)酵的基本條件，研究其穩(wěn)定性對(duì)進(jìn)一步的藥物開(kāi)發(fā)具有指導(dǎo)作用[2]。

干擾素(Interferon，IFN)是慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)抗病毒治療的首選藥物之一[3-7]。其中IFNα2b是FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)抗HBV藥，但是臨床治療時(shí)IFNα2b在體內(nèi)容易擴(kuò)散降解，未能在肝臟形成有效的抗病毒作用濃度[8]。為了達(dá)到抗病毒效果，藥物劑量常要加大，藥物劑量的加大也加重了其不良反應(yīng)，又容易產(chǎn)生耐藥性HBV，從而影響療效[9]。重組肝靶向干擾素是將來(lái)源于瘧原蟲(chóng)環(huán)子孢子蛋白的肝靶向肽CSP I-plus與IFNα2b進(jìn)行融合，利用CSP I-plus高效特異的肝細(xì)胞靶向性將IFNα2b導(dǎo)向肝臟[10-12]，使其在肝臟富集，從而提高了干擾素治療慢性HBV感染的特異性，減少全身用量，降低毒副反應(yīng)，提高量效比，具有良好的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)室成功克隆了肝靶向干擾素(IFN-CSP)基因，并將其轉(zhuǎn)入原核表達(dá)系統(tǒng)菌株E.coliBL21，構(gòu)建了肝靶向干擾素工程菌株E.coliBL21/pET32a-IFN-CSP，并申請(qǐng)了專利。本文旨在研究該菌株的遺傳穩(wěn)定性，按照國(guó)家醫(yī)藥監(jiān)督管理局對(duì)基因重組產(chǎn)品的要求，對(duì)該菌株在傳代過(guò)程中的生長(zhǎng)特性、遺傳和表達(dá)穩(wěn)定性等進(jìn)行鑒定。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

含IFN-CSP基因的重組工程菌株E.coliBL21/pET32a-IFN-CSP為本實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶KpnI、Hind Ⅲ，Taq DNA 聚合酶，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自TaKaRa公司；TIANpure Midi Plasmid Kit為北京TIANGEN公司產(chǎn)品；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Fermentas公司；氨芐青霉素購(gòu)自Amresco公司，酵母提取物和蛋白胨為Oxiod 公司產(chǎn)品；丙烯酰胺、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺、SDS購(gòu)自Sigma公司；TEMED為自北京鼎國(guó)生物公司產(chǎn)品。其他化學(xué)試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 菌株傳代方法及質(zhì)粒穩(wěn)定性鑒定

將凍存-80 ℃ 冰箱中的第 0 代工程菌菌種劃線接種于LB (AMP+) 固體平板上，37 ℃培養(yǎng)16～18 h 后，挑取單菌落繼續(xù)劃線培養(yǎng)，每傳1 次記為1 代。采用復(fù)制平板法，分別挑取傳代過(guò)程中第0、10、20、30、40、50 代的單菌落100個(gè)復(fù)制到含AMP 和不含AMP的LB 固體平板上，37℃培養(yǎng)14～16 h，記數(shù)菌落數(shù)，計(jì)算工程菌在有抗生素選擇壓力下傳代時(shí)質(zhì)粒的穩(wěn)定性。

質(zhì)粒穩(wěn)定性(%)= LB ( AMP+) 固體平板上的菌落數(shù)/LB (AMP-) 固體平板上的菌落數(shù)。

1.2.2 菌落形態(tài)和生長(zhǎng)觀察

與從原代種子接出的培養(yǎng)物對(duì)比，觀察上述平板上傳代工程菌菌落形態(tài)變化。菌體用生理鹽水洗3次后，用少量生理鹽水懸浮，按革蘭染色方法，光學(xué)顯微鏡下觀察。同時(shí)接種單菌落到含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，用 LB 培養(yǎng)基作為對(duì)照，測(cè)定OD600，確定生長(zhǎng)速度的變化。

1.2.3 目的基因的PCR 鑒定

分別挑取第0、10、20、30、40 和50 代工程菌菌種接種于LB 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)夜，用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。根據(jù)肝靶向干擾素基因的DNA 序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0 引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，以質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增鑒定，1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 質(zhì)粒酶切鑒定

挑取第0、10、20、30、40 和50 代單菌落，LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒進(jìn)行KpnI、Hind Ⅲ 雙酶切，1.5% 瓊脂糖電泳鑒定酶切片段。

1.2.5 插入片段DNA 序列測(cè)定

取第50 代重組工程菌菌株委托Invitrogen公司進(jìn)行序列鑒定。

1.2.6 肝靶向干擾素在工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取工程菌單菌落到5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，然后將此菌液按1∶100比例接種到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600=0.8時(shí)，加入終濃度為0.4 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)6 h。離心收集菌沉進(jìn)行15% SDS-PAGE電泳。

2 結(jié)果

2.1 工程菌形態(tài)與生長(zhǎng)速率的觀察

在LB(AMP+)固體平板上生長(zhǎng)的各代工程菌菌落呈典型的大腸桿菌菌落形態(tài)：白色，外表濕潤(rùn)光滑，直徑1 ～1.5 mm 的圓形隆起；無(wú)雜菌生長(zhǎng)。對(duì)各代工程菌進(jìn)行革蘭染色，光鏡下均為革蘭陰性、兩端呈鈍圓的短小桿菌，與原代工程菌形態(tài)相同。原代和第10、20、30、40 和50 代菌株在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h時(shí)的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表1，結(jié)果顯示工程菌株在傳代過(guò)程中生長(zhǎng)情況沒(méi)有顯著差別。

表1 工程菌株在不同傳代次數(shù)時(shí)的生長(zhǎng)量

2.2 工程菌連續(xù)傳代質(zhì)粒穩(wěn)定性

表2 工程菌株傳代時(shí)的質(zhì)粒穩(wěn)定性

工程菌株在有AMP選擇壓力情況下，在LB 固體平板上傳代過(guò)程中質(zhì)粒穩(wěn)定性接近100%(表2)。

2.3 目的基因的PCR 鑒定

以提取的各代菌種重組質(zhì)粒作為模板，對(duì)肝靶向干擾素基因進(jìn)行PCR 特異擴(kuò)增， 結(jié)果(圖1)顯示各代的PCR 結(jié)果與0 代一致，均在約570 bp 處有清晰的條帶，大小與目的片段相符，說(shuō)明各代工程菌中的肝靶向干擾素基因未丟失。

圖1 IFN-CSP 的PCR擴(kuò)增

2.4 質(zhì)粒酶切鑒定

瓊脂糖電泳顯示第0、10、20、30、40、50 代工程菌的重組質(zhì)粒經(jīng)KpnI和Hind Ⅲ 雙酶切后，均可以切出約570 bp 的片段，與原始工程菌的目的基因大小一致 (圖2) ，進(jìn)一步說(shuō)明了各代工程菌中的肝靶向干擾素基因未丟失。對(duì)第50代工程菌進(jìn)行DNA 序列測(cè)定，結(jié)果顯示插入的DNA 序列與原始序列一致，沒(méi)有發(fā)生突變。

圖2 重組質(zhì)粒的酶切圖譜

2.5 肝靶向干擾素在工程菌株中的表達(dá)

圖3 誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)15% SDS-PAGE電泳染色后，可見(jiàn)在大小約39 kDa (因載體pET32a具有Trx標(biāo)簽蛋白，分子量約為17.6 kDa；而肝靶向干擾素分子量約為21.5 kDa) 處出現(xiàn)蛋白條帶，原代菌種和傳代10，20，30，40，50代后的菌種在總蛋白電泳中所有蛋白條帶位置和表達(dá)水平無(wú)明顯差別 (圖3) 。

3 討論

基因工程菌株的遺傳穩(wěn)定性在整個(gè)生產(chǎn)質(zhì)控過(guò)程中起到關(guān)鍵的作用，是高水平發(fā)酵的基本條件，直接影響重組蛋白的表達(dá)、純化乃至產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)[13]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)從不同角度研究大腸桿菌、酵母菌等不同類工程菌的遺傳穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)基因工程菌中重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性一般表現(xiàn)為兩種形式，一種是分離分配不穩(wěn)定性，一般在細(xì)胞分裂時(shí)引起，指整個(gè)重組質(zhì)粒分子從受體細(xì)胞中丟失或逃逸的現(xiàn)象，這一種是質(zhì)粒丟失的主要原因；另一種是結(jié)構(gòu)序列不穩(wěn)定性，即重組質(zhì)粒上某一區(qū)域的序列發(fā)生缺失、修飾、重排和插入等現(xiàn)象導(dǎo)致的表觀生物學(xué)功能喪失，這種對(duì)質(zhì)粒主要遺傳標(biāo)記丟失影響較小[14，15]。遺傳穩(wěn)定性高，目的基因量多，表達(dá)產(chǎn)物含量也高；反之，遺傳穩(wěn)定性低時(shí)，目的基因量少，基因產(chǎn)物的量也少[16]。因此，菌種的遺傳穩(wěn)定性差異決定了菌種的保存方式和傳代次數(shù)，具有重要的實(shí)際指導(dǎo)意義。

本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建凍存-80℃ 冰箱中的重組工程菌E.coliBL21/pET32a-IFN-CSP，經(jīng)連續(xù)劃線傳代50 代以后，仍然保持與原代菌株具有相同的菌落大小和形態(tài)，顯微鏡下特征亦無(wú)明顯差異，表明該工程菌株傳代后形態(tài)特征是穩(wěn)定的。工程菌株連續(xù)傳代質(zhì)粒穩(wěn)定性接近100%，在LB液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況基本一致，表明該工程菌株具有質(zhì)粒的分裂穩(wěn)定性。PCR鑒定、雙酶切電泳鑒定和測(cè)序結(jié)果顯示該工程菌株菌中攜帶的重組質(zhì)粒在傳代前后的限制性內(nèi)切酶圖譜沒(méi)有發(fā)生變化，基因序列亦未突變，表明該工程菌株具有質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，目的蛋白在原代和第10、20、30、40、50代中都有表達(dá)，且表達(dá)量沒(méi)有明顯差別，它們?cè)赟DS-PAGE中的帶型也基本一致，表明該工程菌株具有表達(dá)穩(wěn)定性。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)工程菌E.coliBL21/pET32a-IFN-CSP連續(xù)傳代50 代后生長(zhǎng)特性，pET32a-IFN-CSP質(zhì)粒的PCR鑒定、酶切圖譜、測(cè)序和菌株蛋白表達(dá)水平的分析，結(jié)果顯示重組工程菌經(jīng)50次傳代后以上指標(biāo)均與原始菌株相同，證明該工程菌株遺傳穩(wěn)定性良好，為其將來(lái)應(yīng)用于大規(guī)模的發(fā)酵提供了有利保障，也為重組肝靶向干擾素的應(yīng)用開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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