陳玉敏 王金林 師鎖江 崔 杰

1.陜西省安康市中心醫(yī)院腫瘤科，陜西安康 725000；2.廣東省東莞市人民醫(yī)院普外科，廣東東莞 523059；3.陜西省安康市中心醫(yī)院腎病科，陜西安康 725000

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，有發(fā)病率高、轉(zhuǎn)移率高、病死率高、早期診斷率低、根治切除率低、5年生存率低等特點(diǎn)。胃癌的死亡大多由于手術(shù)及化療后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，因此腫瘤微殘留或微轉(zhuǎn)移是影響胃癌患者預(yù)后的重要因素。RT-PCR已廣泛應(yīng)用于檢測(cè)腫瘤患者在外周血、淋巴結(jié)、骨等病灶的微轉(zhuǎn)移，且顯示了較高的敏感性和特異性[1]。在影像學(xué)意義上，當(dāng)腫瘤細(xì)胞還沒有形成轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)前，某些腫瘤相關(guān)標(biāo)志物就會(huì)出現(xiàn)在外周血內(nèi)。因此，選擇合適的RT-PCR擴(kuò)增標(biāo)志物是關(guān)鍵之處。角蛋白家族（CK）及多形上皮細(xì)胞粘蛋白（polymorphic epothelial mucin）是目前研究較多的胃癌微轉(zhuǎn)移腫瘤標(biāo)志物[2]，二者都在上皮來源的惡性腫瘤中有表達(dá)。CK-19作為細(xì)胞角蛋白家族的一種主要分布于上皮組織內(nèi)，是構(gòu)成細(xì)胞骨架的中間微絲[3]，其已被認(rèn)為是檢測(cè)循環(huán)癌細(xì)胞的敏感標(biāo)志物[4]。MUC-1是多形上皮細(xì)胞黏蛋白（polymorphic epothelial mucin）的核心蛋白基因，已有人將其應(yīng)用于RT-PCR檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移[5]。本研究用熒光定量RT-QPCR方法探討早期胃癌患者外周血CK-19 mRNA及MUC-1 mRNA的表達(dá)的意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集和保存

采集陜西省安康市中心醫(yī)院2009年3月～2012年3月期間住院的96例初治胃癌患者，男56例，女40例；腺癌37例，鱗癌23例，腺鱗癌21例，其他類型15例；年齡＞60歲71例，≤60歲25例；分期Ⅰa期13例，Ⅰb期24例，Ⅱ期59例；并采集30例胃良性疾病患者和30例健康人的外周血作為對(duì)照組。比較三組人群在年齡、病理類型、性別和原發(fā)部位等一般情況，其差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（上述4個(gè)因素均P＞0.05，表2）。胃腺癌MGC-803細(xì)胞株為本單位保存。血液標(biāo)本均為空腹外周靜脈血，負(fù)壓抽取，并棄首1 mL，以防上皮細(xì)胞污染標(biāo)本，后抽取約1 mL外周血標(biāo)本（肝素抗凝）。將血液標(biāo)本和對(duì)照細(xì)胞抽提總RNA后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA分成2份，于-20℃凍存保存，在6個(gè)月內(nèi)進(jìn)行下一步的RT-PCR反應(yīng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 外周血總RNA的抽提 外周血中總RNA用吸附柱抽提后，通過紫外分光光度法和1%瓊脂糖凝膠凝膠電泳檢測(cè)RNA，確定其濃度、純度及完整性。由Genebank中查得相應(yīng)序列，并查閱相關(guān)文獻(xiàn)[6-7]，設(shè)計(jì)CK-19 mRNA及MUC-1 mRNA的引物，3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）內(nèi)參照引物，由Takara生物科技公司合成，序列如下：CK-19 mRNA（正 義 鏈）：5’-AGGTGGATTCCGCTCCGGGCA-3’；CK-19 mRNA（反義鏈）：5’-ATCTTCCTGTCCCTCGAGCA-3’；擴(kuò)增片段460bp；MUC-1mRNA（正義鏈）：5’-ATGCCAGTAGCACT CACCATAG-3；MUC-1 mRNA（反義鏈）：5’-CAGCCAAG GCAATGAGATAGAC-3’；擴(kuò)增片段510 bp；GAPDH（正義鏈）：5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’；GAPDH（反義鏈）：5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’；擴(kuò)增片段452 bp。為保證本部分實(shí)驗(yàn)篩選出的標(biāo)本能夠符合RT-QPCR實(shí)驗(yàn)的要求，本部分用于RT-PCR與RT-QPCR實(shí)驗(yàn)使用的引物序列應(yīng)保持一致，

1.2.2 cDNA一條鏈的制備 根據(jù)測(cè)得的RNA濃度加入2μg作為模板，RNA，總反應(yīng)體系為20μg，照循cDNA合成試劑盒（Tiangen Biotech）說明，合成cDNA，于-20℃保存。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng) RT-PCR反應(yīng)體系為20μL：DEPC水12μL，cDNA 2.5μL，正反義鏈引物（濃度為10μmol/L）各1μL，TakaRa Taq酶0.5μL，dNTP 2.0μL，10×PCR Buffer 2.0μL。CK-19 PCR擴(kuò)增：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性15 s、60.5℃退火10 s、70℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；70℃終延伸2 min。MUC-1的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，68℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，68℃終延伸7 min。1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果觀察，在460 bp處有條帶的為CK-19陽性表達(dá)樣本，否者為陰性；在510 bp處有條帶的為MUC-1陽性表達(dá)樣本，否則為陰性。實(shí)驗(yàn)組中，陽性對(duì)照為MGC-803細(xì)胞株。根據(jù)結(jié)果，篩選出有CK-19mRNA表達(dá)的cDNA，進(jìn)行下一步的RTQPCR反應(yīng)。

1.2.4 RT-QPCR反應(yīng) 實(shí)驗(yàn)中每個(gè)樣本都有內(nèi)標(biāo)。模板來自RT-PCR反應(yīng)篩選結(jié)果，44例CK-19 mRNA陽性表達(dá)的cDNA。其中T1N0期胃癌患者中：高分化1例，中分化1例、低分化2例，未分化0例；T1N1期胃癌患者：高分化1例，中分化3例，低分化6例，未分化5例；Ⅱ期胃癌患者：高分化2例，中分化4例，低分化10例，未分化9例。RTQPCR實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)Golden Easy PCR Kit試劑盒（Tiangen Biotech）說明書，反應(yīng)體系為25μL：20×SYBR solution與2.5×Real Master Mix混合后取11.25μL、水10.75μL、正反義鏈引物（濃度為10μmol/L）各1μL、模板1μL。RTQPCR反應(yīng)條件，參考RT-PCR反應(yīng)條件設(shè)定：95℃預(yù)變性2 min、95℃變性15 s、60.5℃退火30 s，30個(gè)循環(huán)；最后階段：94℃變性15 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本文使用SPSS 16.0軟件對(duì)RT-PCR反應(yīng)的結(jié)果進(jìn)行分析，對(duì)數(shù)據(jù)的χ2檢驗(yàn)，并用Fisher確切概率法處理，以P＜0.05為差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)44例胃癌患者的RT-QPCR反應(yīng)結(jié)果數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)后，用MedCalc統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)繪制受試者工作特征曲線（ROC曲線），計(jì)算AUC（當(dāng)AUC在0.7～0.9時(shí)具一定準(zhǔn)確性），選定分界值，從而找出診斷試驗(yàn)最佳特異性和微轉(zhuǎn)移診斷敏感性的效果臨界值。

2 結(jié)果

2.1 抽提總RNA的檢測(cè)

抽提的總RNA的檢測(cè) 對(duì)試驗(yàn)中抽提的RNA，在1%瓊脂糖凝膠上電泳溴化乙錠（EB）染色，測(cè)定OD260nm，OD260nm/OD280nm。凝膠電泳結(jié)果，兩條RNA主帶清晰，28s條帶約是18s條帶亮度的2倍，并且測(cè)得OD260nm/OD280nm值在1.80～1.99之間。說明抽提的RNA可用于逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。結(jié)果見圖1。

圖1 部分樣本RNA提取結(jié)果

圖2 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組RT-PCR電泳

2.2 RT-PCR的結(jié)果及其分析

2.2.1 CK-19 mRNA、MUC-1 mRNA在外周血中的表達(dá) 部分外周血標(biāo)本經(jīng)RT-PCR，凝膠電泳結(jié)果見圖2。凝膠電泳后，在成像系統(tǒng)下，有MUC-1，CK-19 mRNA表達(dá)的標(biāo)本分別在510 bp和460 bp處有條帶出現(xiàn)。

2.2.2 CK-19 mRNA及MUC-1mRNA在外周血中的表達(dá) 96例胃癌患者、30例胃部良性疾病患者、30例健康人外周血標(biāo)本中，CK-19 mRNA、MUC-1 mRNA的陰性，陽性樣本數(shù)據(jù)分析，合并后與胃癌組比較采用χ2檢驗(yàn)，可見CK-19 mRNA組差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），MUC-1 mRNA組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

表1 外周血中CK-19 mRNA、MUC-1mRNA的表達(dá)（例）

2.2.3 影響CK-19 mRNA表達(dá)的臨床相關(guān)因素 因MUC-1 mRNA無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）不適合作為胃癌在外周血中微轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志，故不再進(jìn)行后續(xù)的分析。χ2檢驗(yàn)CK-19 mRNA的表達(dá)與臨床相關(guān)因素的相關(guān)性，早期胃癌外周血中CK-19 mRNA的表達(dá)，與胃癌的分化程度、TNM分期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而與年齡、性別、是否吸煙、病理類型等無關(guān)（P＞0.05）。見表2。

表2 CK-19 mRNA表達(dá)與臨床相關(guān)因素[n（%）]

2.3 RT-QPCR反應(yīng)結(jié)果

ROC曲線分析：于置信區(qū)間（95%）內(nèi)，效果臨界值設(shè)為0.2358時(shí)，44例RT-QPCR陽性樣品，42例高于此截?cái)嘀?，假陰?例。ROC曲線準(zhǔn)確度和靈敏度分別為77.37%和95.45%，AUC值為0.897，具一定準(zhǔn)確性。結(jié)果見圖3。

3 討論

3.1 CK-19作為胃癌外周血微轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志

目前確定微轉(zhuǎn)移的主要方法是對(duì)外周血中腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)[8]。CK-19作為角蛋白中的一種，主要分布在單層上皮細(xì)胞中，在胃癌細(xì)胞當(dāng)中角蛋白的含量升高[9]。而外周血中不含有上皮細(xì)胞，即無CK-19蛋白表達(dá)，故如果在胃癌患者的外周血中檢測(cè)到CK-19 mRNA，即可診斷為微轉(zhuǎn)移[7-10]。

使用外周血腫瘤標(biāo)志物診斷微轉(zhuǎn)移，是只需要患者提供血液樣本，并可進(jìn)行高通量，高靈敏度的檢測(cè)[11-12]。本研究使用CK-19 mRNA作為分子標(biāo)志物，通過RT-QPCR技術(shù)來檢測(cè)早期胃癌患者外周血微轉(zhuǎn)移，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外周血中CK-19 mRNA的表達(dá)與胃癌的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性較大，較MUC-1 mRNA更適合作為分子標(biāo)志物。通過RT-QPCR技術(shù)來檢測(cè)其表達(dá)，監(jiān)測(cè)早期胃癌患者外周血微轉(zhuǎn)移是有效可行的。

3.2 CK-19 mRNA在外周血表達(dá)的診斷意義

ROC曲線的評(píng)價(jià)方法，是根據(jù)實(shí)際情況，把結(jié)果分別劃分為正常、大致正常、可疑、大致異常和異常五個(gè)區(qū)間，再進(jìn)行進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)分界值以假陽性率（1-特異度）為橫坐標(biāo)、真陽性率（靈敏度）為縱坐標(biāo)繪制ROC曲線；該曲線坐標(biāo)左上角的準(zhǔn)確性最高，提示假陽和假陰性的總數(shù)最少，而AUC的正常值應(yīng)在0.5～1.0，并且越接近于1，則診斷效果越接近真實(shí)。筆者以44例胃癌患者的數(shù)據(jù)，繪制ROC曲線，將健康對(duì)照組均值的95%可信區(qū)間的上限作為分界值，找出診斷試驗(yàn)效果最好即特異性和敏感性最高的臨界值，并計(jì)算AUC。

本研究是用通過RT-QPCR法檢測(cè)初治早期的胃癌患者的外周血微轉(zhuǎn)移，期望在目前沒有統(tǒng)一的儀器、實(shí)驗(yàn)方法、實(shí)驗(yàn)試劑且各研究結(jié)果之間存在一定的分歧的研究現(xiàn)狀下，為臨床診斷微轉(zhuǎn)移提供一個(gè)方法。外周血中CK-19 mRNA可以作為胃癌微轉(zhuǎn)移的一個(gè)較理想的分子標(biāo)志。而在診斷結(jié)果的判讀上使用ROC曲線，由于其不固定分類界值，是依靠使用者的專業(yè)知識(shí)來分析確定。標(biāo)準(zhǔn)過于放寬可能會(huì)將正常的樣本納入陽性的范圍；標(biāo)準(zhǔn)過于嚴(yán)格，又可能會(huì)錯(cuò)誤判斷，耽誤患者治療或者是漏掉陽性。筆者期望今后能進(jìn)行更大樣本量的分析，以進(jìn)一步完善診斷模型。且若存在微轉(zhuǎn)移情況是否預(yù)示著該患者后續(xù)病情會(huì)更差，或是在手術(shù)后胃癌更容易復(fù)發(fā)，暫時(shí)還沒有研究進(jìn)行探究，需要有足夠樣本數(shù)量的臨床研究以及患者后續(xù)的觀察記錄進(jìn)一步驗(yàn)證。

[1]楊士軍，陸衛(wèi)平，鮑艷梅，等.血清CK18及CA72-4水平在胃癌診治中的臨床價(jià)值[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012，33（13）：1593-1594.

[2]丁明鋒，許軍，劉昶.RT-PCR擴(kuò)增細(xì)胞角質(zhì)蛋白CK20mRNA診斷胃癌腹膜微轉(zhuǎn)移的研究[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2012，20（6）：1152-1154.

[3]何成全，詹乾鋼，單水陽，等.胃癌患者外周血中CK19，CK20表達(dá)的臨床研究[J].中國腫瘤臨床，2005，32（7）：401-403.

[4]彭云香，毛靜濤，魏君，等.CK19和EpCAM在胃癌組織中表達(dá)的循證分析[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2011，37（2）：296-299.

[5]王永強(qiáng)，歐陽曉輝，王萬祥.巢式PCR檢測(cè)胃癌患者外周血CK19mRNA的臨床意義[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志，2011，43（3）：268-270.

[6]Peck K，Sher YP，Shih JY，et al.Detection and quantitation of circulating cancer cells in peripheral blood of lung cancer patients[J].Cancer Res，1998，58（13）：2761-2765.

[7]章希煒，范萍，楊宏宇，等.胃腸道惡性腫瘤外周血微轉(zhuǎn)移的檢測(cè)及其臨床意義[J].中華腫瘤雜志，2003，25（1）：66-68.

[8]趙宏偉，劉宏斌，韓曉鵬，等.流式細(xì)胞術(shù)在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移診斷中的應(yīng)用價(jià)值[J].中國腫瘤臨床，2009，（12）：661-664.

[9]Suo Z，Holm R，Nealand JM，et al.Squamous cell carcinomas：an immunohistochemical study of cytokeratina and involucrin in primary and metastatictumors[J].Histopathology，1993，23（1）：45-54.

[10]Benlloch S，Galbis J，Peiro FM，et al.Role of CEA，PLUNC and CK19 mRNA expression in lymph nodes from resected stage I non-small celllungcancer（NSCLC）patients（p）asmarkersofoccultmicrometastasis：a pilot etudy[J].Jpn J Clin Oncol，2005，23（16S）：9654.

[11]Pelkey TJ，F(xiàn)rison HF，Bruns G，et al.Molecular and immunological detection of circulating tumor cells and micrometastasis from solid tumor[J].Clin Chem，1996，2（9）：1369-1381.

[12]侯睿哲，彭云香，毛靜濤，等.胃癌表達(dá)EpCAM和CK19臨床意義的研究[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2010，14（5）：707-709.