人顆粒裂解肽突變子在大腸埃希菌中的構(gòu)建與表達(dá)研究

趙 銘 劉 冰 王 臻，2 李邦印▲ 張靈霞

1.解放軍第三〇九醫(yī)院，北京 100091；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，江西南昌 330045

最初是由Jongstra等發(fā)現(xiàn)的一種短肽，稱為519，1997年P(guān)ena等把這種短肽命名為顆粒裂解肽（NKG5）[1-2]；NKG5是一種細(xì)胞毒性效應(yīng)蛋白，屬于SAPLIP（saposin like protein）家族成員，它能夠選擇性地在NK細(xì)胞和激活后的T淋巴細(xì)胞中表達(dá)，其天然肽和重組肽都具有廣譜抗菌活性，對(duì)G+和G-細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)均有殺菌活力，如鼠傷寒沙門(mén)菌、單核李司特菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌，真菌有新型隱球菌、白念珠菌，寄生蟲(chóng)有利什曼蟲(chóng)，尤其是對(duì)分枝桿菌有直接的細(xì)胞毒性[1]，它與穿孔素和粒酶在溶淋巴顆粒上有協(xié)同作用[3]。

引起筆者注意的是NKG5在體外不僅表現(xiàn)為對(duì)結(jié)核分枝桿菌很強(qiáng)的殺傷作用，且協(xié)同穿孔素對(duì)細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核桿菌也有很強(qiáng)的殺傷能力[3-5]。文獻(xiàn)報(bào)道，顆粒裂解肽在72 h內(nèi)可以殺滅90%的哺乳動(dòng)物結(jié)核菌素（MTB），其殺滅作用呈劑量依賴性[6]。

眾所周知，對(duì)結(jié)核桿菌有效的藥物最早是30年前發(fā)現(xiàn)的，更為嚴(yán)重的是結(jié)核桿菌對(duì)為數(shù)很少的治療藥物均已產(chǎn)生了不同程度的耐藥性。全球亟需對(duì)付結(jié)核桿菌的有效措施，包括預(yù)防性和治療性疫苗與新型藥物，而NKG5有可能成為抗結(jié)核病的一種新型生物制劑。因此，筆者所在課題組開(kāi)展了一系列針對(duì)NKG5的研究。本論文根據(jù)從Genebank中報(bào)道的NKG5基因序列，設(shè)計(jì)把NKG5的部分氨基酸編碼Cys69、96、107、132、138位變?yōu)镾er，采用寡核苷酸合成方式，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)拼接成為NKG5-Ser編碼序列，然后在原核細(xì)胞中融合表達(dá)，擬為進(jìn)一步對(duì)比研究顆粒裂解肽殺滅結(jié)核菌的功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)于Qiagen，限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BamHⅠ、T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB，2×pfu、Master Mix、DNA mole wheight marker、羊抗小鼠GST單抗和HRP標(biāo)記的羊IgG購(gòu)自天根生物技術(shù)（北京）有限公司，發(fā)光試劑盒購(gòu)、GST純化樹(shù)脂和還原型谷胱甘肽購(gòu)自威格拉斯生物技術(shù)（北京）有限公司，Red Taq購(gòu)自賽百盛生物技術(shù)有限公司；pGEX-4T-1、大腸埃希菌BL21（DE3）pLysS、DH5α由解放軍第三〇九醫(yī)院結(jié)核病研究所分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 搜索Gene bank中hNKG5的cDNA序列（登錄號(hào)：NM 006433），設(shè)計(jì)合成氨基酸編碼全序列并設(shè)計(jì)一對(duì)引物，其序列如下（下劃線部分為BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)）上游引物5′-CTACTAGCTAGCGGATCCGGCCGTGACTACCGCACC-3′，下游引物5′-CATCGCTCG AGCTCATTATGGACCTGTAGAAGGGATACTCAAACGGAGGTCCTCG C-3′。

1.2.2 顆粒裂解肽氨基酸編碼序列的克隆及序列測(cè)定 采用合成的寡核苷酸序列，拼接成NKG5-Ser目的基因，將純化的目的片段連接到克隆載體pGEMT中，轉(zhuǎn)化入處于感受態(tài)的大腸埃希菌DH5α，涂布于含有相應(yīng)抗生素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，以藍(lán)白斑篩選方法初步篩選陽(yáng)性克隆，挑取準(zhǔn)陽(yáng)性的單個(gè)白色菌落，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定，并且對(duì)陽(yáng)性重組子進(jìn)一步提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切確定其重組片段的大小，最后選擇重組質(zhì)粒（pGEMT-NKG5-Se）在ABI PRISMTM 3700型DNA自動(dòng)測(cè)序儀上測(cè)序（由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn)）。

1.2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá) 用BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pGEMT-NKG5-Ser，回收目的基因，將其進(jìn)一步克隆到被同樣雙酶切的原核表達(dá)載體pGEX-4T-1中，構(gòu)建重組的原核表達(dá)載體（pGEX-4T-1-NKG5-Ser），轉(zhuǎn)化大腸埃希菌，用PCR方法及雙酶切瓊脂糖電泳圖進(jìn)行鑒定。

1.2.4 融合蛋白的表達(dá)及條件優(yōu)化 用滅菌牙簽挑取重組菌落BL21（DE3）pLysS，接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)夜，取培養(yǎng)物按1∶50比例轉(zhuǎn)種于新鮮含氨卞西林的LB培養(yǎng)液中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8，加入IPTG至終濃度1mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)。繼續(xù)培養(yǎng)，分不同時(shí)間，分批取1 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)物，離心集菌體沉淀，用100μL 2×SDS樣品緩沖液重懸沉淀，然后100℃水浴5 min，12 000 r/min離心10 min，取10μL進(jìn)行12% SDS-PAGE，觀察表達(dá)量，其結(jié)果是獲得優(yōu)化對(duì)IPTG誘導(dǎo)時(shí)間。

1.2.5 蛋白純化 接種pGEX-4T-1-NKG5-Ser/BL21菌，37℃、200 r/min振搖過(guò)夜，以1∶50比例接種于500 mL的LB培養(yǎng)基，37℃、200 r/min振搖4 h后，加入IPTG至終濃度1mmol/L，28℃、200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)4 h，收集菌液，用預(yù)冷的PBS溶液重懸菌體沉淀，進(jìn)行超聲破菌后，加入TritonX-100至終濃度為1%，高速離心取上清。上清加入預(yù)裝有還原型谷胱甘肽親和層析柱，5倍柱床體積的PBS，最后用含有還原性谷胱甘肽的洗脫液洗出GST-NKG5-Ser，對(duì)洗脫蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.6 免疫印跡（Western blot）分析 純化后的融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移于硝酸纖維素（NC）膜上（半干狀態(tài)可以密封低溫保存），用雙蒸水漂洗NC膜；加入封閉液（含5%脫脂奶粉和0.05%Tween20的pH7.5的TBS），37℃孵育1 h；用TBS在37℃洗膜3次，每次10 min，然后依次加鼠GST單克隆抗體（37℃1 h，洗膜同前）和HRPO標(biāo)記的羊抗鼠二抗（37℃1 h，洗膜4次，每次15 min），雙蒸水沖洗，終止反應(yīng)，取出，按照試劑盒操作步驟進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，壓片，洗片，觀察印跡結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增獲得目的基因

利用合成寡核苷酸的方法拼接得目的基因，大小約為240 bp的顆粒裂解肽片段（圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒pGEM-T-NKG5-Ser的鑒定

目的基因克隆到載體pGEMT中，重組子質(zhì)粒經(jīng)雙酶切及PCR鑒定均可以得260 bp大小的片段（圖2）。連接了重組質(zhì)粒由上海生物工程公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果表明，所克隆的DNA片段所編碼的氨基酸序，與預(yù)期的氨基酸序列一致，成功地將半胱氨酸定位突變?yōu)镾er。與突變子氨基酸序列相應(yīng)的NKG5氨基酸部分為：GRDYRTCLTIVQKLKKMVDKPTQRSVSNAATRVCRTGRSR WRDVCRNFMRRYQSRVIQGLVAGETAQQICEDLRLCIPST GPL。

圖2 pGEMT-NKG5-SerER鑒定

2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建

將雙酶切重組質(zhì)粒r獲得的DNA片段，亞克隆到同樣雙酶切的原核表達(dá)載體pGEX-4T-1r中，構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-NKG5-Ser，重組子質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定及雙酶切鑒定其瓊脂糖電泳圖分別見(jiàn)于圖3a和見(jiàn)圖3b。

2.4 原核表達(dá)及條件優(yōu)化[6]

將重組菌接種于LB＋1%甘油培養(yǎng)液，分別采用24、28、32、37℃進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)，37℃培養(yǎng)28℃誘導(dǎo)及37℃培養(yǎng)32℃誘導(dǎo)，1、2、3、4、5、6、7 h誘導(dǎo)；結(jié)果表明：溫度和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蛋白表達(dá)量有顯著影響（圖4、5）。

2.5 蛋白純化

對(duì)所表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化后，得到純度達(dá)95%以上的重組蛋白，通過(guò)SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)得到一條分子量約為35 kD的融合蛋白條帶（圖6）。

2.6 Western Blot印跡分析

為證實(shí)NKG5-Ser基因得到表達(dá)，采用Western Blot雜交技術(shù)對(duì)原核重組表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示分子量約為29 kD的蛋白條帶能特異性地與鼠抗GST單克隆抗體反應(yīng)（此為GST反應(yīng)），在分子量約為35 kD的位置出現(xiàn)一條特異性反應(yīng)帶（應(yīng)該為GST-Ser融合蛋白）（圖7）；進(jìn)一步證實(shí)該重組蛋白的分子量大小正確。

3 討論

NKG5是一種低分子量多肽，體外實(shí)驗(yàn)表明具有抗微生物功能及殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，其分子機(jī)制可能是通過(guò)神經(jīng)酰氨、caspase依賴/非依賴途徑等來(lái)實(shí)現(xiàn)其功能的，而且它的殺傷功能與其自身二級(jí)結(jié)構(gòu)變化及所攜帶正電荷氨基酸含量亦相關(guān)[7]。有文獻(xiàn)已經(jīng)展開(kāi)了重組NKG5實(shí)驗(yàn)研究，且體外實(shí)驗(yàn)表明重組的9 kD NKG5多肽可以殺傷細(xì)菌、真菌、原蟲(chóng)（比如革蘭陰性或陽(yáng)性細(xì)菌、大型利什曼原蟲(chóng)、新型的隱球菌）等[6-8]。

筆者在以往的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)NKG5在大腸埃希菌中表達(dá)的過(guò)程中可能由于二硫鍵太多，多表達(dá)為包涵體，且影響分子的復(fù)性，其可能會(huì)影響以后的生物活性實(shí)驗(yàn)。因此在本試驗(yàn)中，筆者合成了全序列編碼的寡核苷酸片段，將某些位點(diǎn)突變?yōu)閟er，擬進(jìn)行可溶性表達(dá)探索。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)SDS-PAGE和免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)在分子量約35 kD處可見(jiàn)一條特異性條帶，證明NKG5融合蛋白得到表達(dá)，但表達(dá)量不夠理想。

影響原核表達(dá)系統(tǒng)重組蛋白表達(dá)效率的因素很多，除了載體系統(tǒng)之外，可能還由外源基因本身的特性決定。顆粒裂解肽是具有廣譜的抗病原微生物及殺傷腫瘤細(xì)胞的陽(yáng)離子抗菌肽[9]。有學(xué)者等對(duì)顆粒裂解肽的晶體結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，顆粒裂解肽含有5個(gè)α-螺旋（H1-H5）結(jié)構(gòu)，較多的正電荷與穩(wěn)定的兩性α-螺旋相結(jié)合有助于提高殺菌活性[10-11]。某些結(jié)構(gòu)域可能造成大腸桿菌部分細(xì)胞的破裂[12-13]，推測(cè)其機(jī)制可能是從細(xì)胞內(nèi)部作用于內(nèi)膜和外膜。而破裂細(xì)胞中的少量外源蛋白可能大多被蛋白酶降解，未被降解的微量外源蛋白作用于其他細(xì)胞的外膜[14]。另一方面，外源蛋白還可能抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄[11]，進(jìn)而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝。因此，可能是重組肽的結(jié)構(gòu)本身直接或者間接影響了工程菌的表達(dá)活性。

綜合上述，筆者獲得了重組蛋白的生物工程菌，足以為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)中提出了其重組蛋白在原核系統(tǒng)表達(dá)量偏低的問(wèn)題，若提高NKG5-ser表達(dá)量，使之高效表達(dá)為可溶性的活性肽，可能還需要使用其他載體系統(tǒng)，或者在人源性或動(dòng)物源性永生化細(xì)胞系中進(jìn)行體外真核細(xì)胞表達(dá)的研究，這值得進(jìn)一步探索。

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