王章存，李樂靜，袁道強(qiáng)，崔勝文，趙學(xué)偉，王吉中，胡金強(qiáng)

(鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

大豆以其豐富的蛋白質(zhì)含量、合理的氨基酸組成和保健功能而深受人們的喜愛，大豆蛋白食品的種類也越來越多。大豆是公認(rèn)的八大食物過敏源之一[1-2]，它可導(dǎo)致人體腹瀉、皮膚發(fā)紅等過敏反應(yīng)，對嬰幼兒的影響更為嚴(yán)重[3]。因此，大豆的食品安全問題在國內(nèi)外均受到高度關(guān)注。研究表明，7S和11S球蛋白是大豆中的主要蛋白質(zhì)，其中豆球蛋白(glycinin)和β-伴球蛋白(β-conglycinin)也是抗原性較高的蛋白質(zhì)。β-伴球蛋白是分子質(zhì)量為140～180ku的糖蛋白，由α、α’和β 3種亞基(分子質(zhì)量分別為58～77ku、58～83ku、42～53ku)按一定方式組合而成的三聚體[4-5]，豆球蛋白是分子質(zhì)量為300～380ku的六聚體復(fù)合物，每個(gè)亞基由酸性(分子質(zhì)量為31～45ku)和堿性(分子質(zhì)量為18～20ku)多肽鏈通過－S－S－連接組成[6]。大豆蛋白的抗原性主要與這些蛋白質(zhì)亞基結(jié)構(gòu)及其形成的抗原決定簇有關(guān)[7-8]。

豆粕是提取大豆蛋白的主要原料，也是動(dòng)物飼料中不可缺少的蛋白質(zhì)原料。由于豆粕中含有抗原蛋白，在幼小動(dòng)物飼料中的添加量受到很大限制。因此降低豆粕中的抗原活性是近年來國內(nèi)外營養(yǎng)學(xué)研究的熱點(diǎn)。文獻(xiàn)中關(guān)于大豆蛋白酶解研究較多，但主要以大豆分離蛋白為研究對象，且以改善大豆蛋白溶解、乳化等功能特性為目的，較少涉及酶解過程中大豆蛋白分子結(jié)構(gòu)與抗原性變化的關(guān)系[9-12]。本實(shí)驗(yàn)以低溫脫脂豆粕為原料，選用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶3種不同來源的酶制劑，通過SDS-PAGE和雙抗體夾心法ELISA分析了豆粕酶解過程中大豆蛋白分子亞基組成、含量和抗原性的變化等，比較不同酶制劑降解大豆蛋白抗原性的效果，旨在為制備低抗原性酶解豆粕提供理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂豆粕(蛋白質(zhì)含量45.80%) 山東嘉華油脂有限公司。

堿性蛋白酶(Alcalase，2.4AU/g)、胰蛋白酶(3.3AU/g)丹麥諾維信公司；木瓜蛋白酶(≥50U/g) 北京索萊寶科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、巰基乙醇(ME)、十二烷基硫酸鈉(SDS) 美國Sigma公司；丙烯酰胺(Acr)、N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺(Bis) 美國Amresco公司；N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)、考馬斯亮藍(lán)R250 瑞士Fluka公司；低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白(14400～97400u) 中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所；大豆抗原蛋白酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒(96孔) 日本Nippon肉品包裝研發(fā)中心；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-7C型電泳儀、DYCZ-24DN型電泳槽 北京六一儀器廠；UV-8100 B紫外-可見分光光度計(jì) 北京萊伯泰科儀器公司；TECAN Genios酶標(biāo)儀 東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脫脂豆粕酶解液的制備

取10.0g過60目篩的粉碎豆粕，用水配制成質(zhì)量濃度為10g/100mL的懸浮液，加熱至50℃后保溫50min，然后用1mol/L NaOH調(diào)至酶的最適pH值和溫度(堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶的最適pH值分別為8.0、6.0、8.0；最適溫度為50、40、37℃)，按酶與豆粕質(zhì)量比為1：100比例分別加入蛋白酶，反應(yīng)開始并計(jì)時(shí)。在整個(gè)反應(yīng)過程中，滴加NaOH溶液維持酶反應(yīng)液pH值恒定，并記錄消耗NaOH體積。反應(yīng)到預(yù)定時(shí)間后，將反應(yīng)液在沸水浴中加熱10min滅酶，冷卻至室溫后，2000r/min離心10min，上清液和沉淀部分分別冷凍干燥供分析用。

1.3.2 蛋白質(zhì)的溶解性測定

采用雙縮脲法[13]測定可溶性蛋白質(zhì)含量，蛋白質(zhì)的溶解性按照下式計(jì)算。

1.3.3 SDS-PAGE分析

采用Laemmli系統(tǒng)進(jìn)行SDS-PAGE分析[14]。電泳條件：5%濃縮膠，12%分離膠，初始電壓為80V，當(dāng)電泳前沿進(jìn)入分離膠時(shí)改用110V。采用低分子質(zhì)量蛋白作標(biāo)準(zhǔn)，考馬斯亮藍(lán)R-250染色。酶解沉淀物樣品先用pH10 NaOH溶液提取再加還原樣品緩沖液進(jìn)行電泳分析。

1.3.4 酶解物中大豆過敏原酶聯(lián)免疫分析(ELISA)[15]

樣品制備：可溶性酶解樣品用0.2mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液溶解并做梯度稀釋；水不溶性酶解樣品先用1mol/L NaOH提取1h，2000r/min離心10min，再用0.2mol/L、pH7.4 磷酸鹽緩沖液做梯度稀釋。

測定：將大豆過敏原酶聯(lián)免疫檢測試劑盒從冷藏環(huán)境中取出并在室溫平衡30min，稀釋標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度分別為12、6、3、1.5、0.75μg/mL。標(biāo)準(zhǔn)品孔加入標(biāo)準(zhǔn)品50μL、鏈霉親和素-HRP 50μL(標(biāo)準(zhǔn)品中已事先整合好生物素抗體，故不加)；待測樣品孔加入樣品40μL，然后加入抗大豆過敏原抗體10μL、鏈霉親和素-HRP 50μL；空白對照孔不加樣品，生物素標(biāo)記的抗大豆過敏原抗體，鏈霉親和素-HRP(辣根過氧化物酶)，只加顯色劑A、B和終止液，其余各步操作相同，蓋上封板膜，輕輕振蕩混勻，37℃溫育60min后，揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干，然后每孔先加入顯色劑A 50μL，再加入顯色劑B 50μL，輕輕振蕩混勻，37℃避光顯色10min，最后，每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的OD值。測定在加終止液后10min以內(nèi)進(jìn)行。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度及對應(yīng)的OD450nm值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程為Y=0.0395X+0.1434(R2=0.9947)，式中，Y是OD450nm值，X是標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度/(μg/mL)，再根據(jù)樣品的OD450nm值在回歸方程上計(jì)算出對應(yīng)的樣品質(zhì)量濃度。為便于比較，各部分具有抗原活性蛋白的含量均以原料豆粕質(zhì)量為基數(shù)計(jì)算。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用Origin7.0軟件分析ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶對大豆蛋白溶解性的影響

圖 1 不同酶水解對大豆蛋白溶解性的影響Fig.1 Solubility of soybean protein during hydrolysis

由圖1可知，3種蛋白酶對大豆蛋白的酶解效果有一定差異。堿性蛋白酶酶解10min時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解性由未酶解時(shí)的62.30%快速增加到87.19%，木瓜蛋白酶酶解10min時(shí)增加到80.15%，而胰蛋白酶酶解10min時(shí)僅增加到72.74%。其后隨著酶解時(shí)間的延長，大豆蛋白溶解性雖然增加，但增加幅度均不顯著。至酶解120min時(shí)，3種大豆蛋白酶解物溶解性分別為96.10%、88.90%和80.00%。文獻(xiàn)[11]中用大豆分離蛋白(SPI)的研究結(jié)果也表明胰蛋白酶提高蛋白溶解性的效果不佳。

2.2 SDS-PAGE分析

2.2.1 可溶性酶解物的蛋白質(zhì)亞基分析

為了解不同酶制劑對大豆抗原蛋白的降解過程，豆粕分別經(jīng)堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶水解不同時(shí)間后，用SDS-PAGE方法分析了可溶性酶解物中的蛋白質(zhì)亞基組成及其含量變化。

圖 2 3種蛋白酶水解物可溶性組分SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE analysis of proteins in soluble hydrolysates

由圖2可知，經(jīng)堿性蛋白酶水解10min后，抗原活性較高的大豆β-伴球蛋白(7S)的3個(gè)亞基(α’、α、β)已完全消失，11S球蛋白的38ku酸性亞基和21ku堿性亞基含量也明顯減少。酶解60min時(shí)，38ku亞基完全消失，酶解90min 時(shí)，21ku亞基也幾乎完全消失。同時(shí)，分子質(zhì)量小于14ku組分的含量明顯增加。而整個(gè)酶解過程中，15ku堿性組分始終沒有被酶解的跡象。與堿性蛋白酶的效果相似，用木瓜蛋白酶水解10min后，7S伴球蛋白的亞基和11S球蛋白的酸性亞基幾乎完全消失，但繼續(xù)延長酶解時(shí)間，大豆蛋白的亞基組成和含量變化不大，說明木瓜蛋白酶可以在短時(shí)間內(nèi)發(fā)揮酶解作用。胰蛋白酶對大豆蛋白的水解效果明顯不如堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶。在整個(gè)90min水解過程中，7S伴球蛋白的α’、α、β 3個(gè)亞基始終存在，僅僅是其含量有所減少；而11S球蛋白的酸性和堿性亞基的亞基組成及其含量幾乎無變化，說明胰蛋白酶對11S蛋白幾乎沒有作用。文獻(xiàn)[11]中對大豆分離蛋白的研究也表明，胰蛋白酶的作用效果較差，營養(yǎng)學(xué)研究也表明，動(dòng)物消化道中的蛋白酶對大豆抗原蛋白的消化性不徹底，仍有部分抗原蛋白會(huì)進(jìn)入血液[16-17]。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)中的報(bào)道相吻合。

2.2.2 不溶性酶解物的蛋白質(zhì)亞基分析

豆粕經(jīng)酶解后，仍有少量蛋白質(zhì)成分不能直接在水中溶解。為了全面、準(zhǔn)確分析酶解對豆粕中大豆蛋白分子的影響，用SDS-PAGE法測定水不溶性酶解物蛋白質(zhì)亞基組分。

由圖3可知，在未酶解豆粕中存在大豆脂肪氧化酶(97.40ku)，堿性蛋白酶水解10min時(shí)，大豆脂肪氧化酶、α’、α亞基和66.20ku的組分均已完全消失，11S中的酸性組分含量也大大減少，酶解60min時(shí)已全部消失。木瓜蛋白酶酶解物大部分組分分子質(zhì)量在20.10ku以下，基本無大分子肽段。對于胰蛋白酶酶解物而言，酶解前后大部分組分無大的變化，大豆脂肪氧化酶(97.40ku)和66.20ku的組分隨酶解時(shí)間只有略微的減少，而23.00ku組分變化較明顯，酶解10min時(shí)大部分已消失。對比3種酶對不溶性酶解物的酶解效果，木瓜蛋白酶對大豆抗原蛋白有更明顯的降解效果，胰蛋白酶酶解效果最差。至于酶解物某些不溶性組分與可溶性組分具有相同分子質(zhì)量的亞基而溶解性能不同，可能是它們的聚集狀態(tài)不一樣。用pH10.0氫氧化鈉溶液處理后改變了這種聚集才使其成為可進(jìn)行電泳的溶解物。

圖 3 3種蛋白酶解物水不溶性組分SDS-PAGE圖譜Fig.3 SDS-PAGE analysis of proteins in insoluble hydrolysates (residues)

2.3 ELISA實(shí)驗(yàn)

圖 4 水溶性(A)和不溶性(B)酶解物中抗原蛋白的ELISA結(jié)果Fig.4 Content of allergenic proteins in water soluble and insoluble hydrolysates determined by ELISA

由圖4可知，隨著酶解時(shí)間的延長，水溶性酶解物(圖4A)和不溶性酶解物(圖4B)中具有抗原活性的蛋白質(zhì)(即過敏原)含量明顯降低。可以看出，在未酶解的每克原料豆粕中，抗原性蛋白的含量為195.90mg/g豆粕(其中在可溶性物中為136.50mg/g豆粕，不溶性物中為59.40mg/g豆粕)。用堿性蛋白酶水解10min后，可溶性和水不溶性豆粕酶解物中抗原蛋白含量只剩66.90mg/g豆粕和23.60mg/g豆粕；用木瓜蛋白酶水解10min后，兩部分酶解物中抗原蛋白的含量分別為75.60mg/g豆粕和18.70mg/g豆粕。兩種酶對豆粕抗原蛋白的去除率分別為53.58%和51.80%。隨著酶解時(shí)間的進(jìn)行，酶解物中抗原蛋白含量降低的趨勢變緩，至反應(yīng)120min時(shí)，堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶對豆粕抗原蛋白的去除率分別為75.70%和61.40%。而胰蛋白酶對大豆蛋白亞基和抗原性的降解效果相對較弱。這些ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果與SDS-PAGE中亞基組分的變化趨勢一致。

3 結(jié) 論

對酶解后大豆蛋白質(zhì)分子亞基和抗原性的分析表明，3種蛋白酶的水解效果有明顯的差異。堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的效果較好，酶解10min時(shí)，主要抗原蛋白的亞基已基本消失，抗原活性消除率超過50%。酶解120min時(shí)，兩種酶的抗原性去除率分別為75.70%和61.40%?？梢姡瑝A性蛋白酶和木瓜蛋白酶可有效消除豆粕的抗原活性，而胰蛋白酶的作用效果較差。這與蛋白酶的水解選擇性有關(guān)。

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