賀宗毅，吳天祥*，徐曉寶

(1.重慶市中藥研究院，重慶 400065；2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

灰樹(shù)花(Grifola frondosa)，又名栗子蘑、栗蘑、千佛菌、貝葉多孔菌、甜瓜板、舞茸等。它屬于真菌門(mén)(Eumycota)、擔(dān)子菌亞門(mén)(Basidiomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)、多孔菌屬(Polyporus)的一種大型真菌?；覙?shù)花是一種富含多糖、維生素、氨基酸、蛋白質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽等有效成分的藥、食兩用菌?；覙?shù)花性平味甘在藥用價(jià)值方面可用來(lái)治療小便不利、水腫、腳氣、肝硬化、腹水、糖尿病及高血壓、肥胖等疾病。近年來(lái)的研究表明，灰樹(shù)花中富含的多糖物質(zhì)具有明顯的抗誘變、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤、抗HIV、保肝護(hù)肝等生理活性作用[1-5]。

天麻(Gastrodia tuber)為蘭科多年生寄生菌植物，以蜜環(huán)菌的菌絲或菌絲分泌物為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。天麻主要產(chǎn)于四川、云南、貴州，其干燥塊莖富含天麻素，可以入藥，具有平肝、息風(fēng)、止痙作用，主治頭痛眩暈、肢體麻木、小兒驚風(fēng)、癲癇抽搐等癥。天麻的主要成分包括天麻素(p-hydroxymethylphenyl-β-D-glucopyranoside)、對(duì)羥基苯甲醇(p-hydroxybenzyl alcohol)、香草醇(vanillyl alcohol)、香蘭素(vanillin)等。其中，天麻素是其主要活性成分[6]。許多中草藥需要與真菌共生才能生長(zhǎng)，如天麻就必須與真菌蜜環(huán)菌共生，在傳統(tǒng)中藥炮制過(guò)程中早已有用真菌發(fā)酵中藥的方法。而近年來(lái)，在中藥炮制新技術(shù)發(fā)展中已有許多學(xué)者提出了中藥發(fā)酵制藥技術(shù)的新思路，他們認(rèn)為以藥用真菌發(fā)酵中草藥可以顯著增強(qiáng)其免疫活性，并命名為：“雙向發(fā)酵”。劉高強(qiáng)等[7]在2007年報(bào)道了，中藥中華地鱉蟲(chóng)和蜣螂蟲(chóng)的提取物能刺激靈芝菌體生長(zhǎng)和增加靈芝多糖的產(chǎn)量，同時(shí)他們還說(shuō)明了并不清楚是中藥中的何種成分刺激了靈芝多糖的生產(chǎn)。Liu Gaoqiang等[8]又在2011年報(bào)道蜣螂蟲(chóng)的提取物在一定濃度下能夠刺激靈芝的生長(zhǎng)和靈芝三萜類(lèi)化合物的生產(chǎn)，不過(guò)他們同樣還是沒(méi)有說(shuō)明中藥成分和靈芝在深層發(fā)酵過(guò)程中是如何相互作用的。雖然目前對(duì)于微生物發(fā)酵中藥后，明顯提高其藥用價(jià)值已有諸多報(bào)道，但是對(duì)中藥成分與藥用真菌生長(zhǎng)代謝間相互作用過(guò)程，缺乏深入、系統(tǒng)的研究。

近幾年研究表明向真菌培養(yǎng)基中添加適量的中藥可以促進(jìn)真菌的生長(zhǎng)或提高活性產(chǎn)物的產(chǎn)量[9-10]。Kim等[11]在2010年報(bào)道了中藥成分添加進(jìn)真菌培養(yǎng)基的研究中，以中藥牛蒡子提取物和灰樹(shù)花作為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)灰樹(shù)花分泌的酶能夠?qū)⑴］蜃榆辙D(zhuǎn)化為牛蒡子苷元，并且加入了牛蒡子提取物的灰樹(shù)花發(fā)酵液成分(包括灰樹(shù)花胞外多糖)有抗氧化活性。這些研究都是真菌對(duì)于中藥成分的利用情況，但是加入的中藥成分對(duì)真菌代謝產(chǎn)物的合成途徑是否有無(wú)影響，針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，本研究從灰樹(shù)花代謝途徑入手分析了天麻對(duì)灰樹(shù)花胞外多糖合成的影響。

Looijesteijn等[12]在1999年報(bào)道了，α-葡糖磷酸變位酶(α-PGM)參與了胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)的合成，而葡糖磷酸異構(gòu)酶(PGI)則與乳酸的代謝有關(guān)，這兩種酶是糖酵解途徑(EMP)與EPS合成途徑的重要分支點(diǎn)。而葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)是這兩種酶的共同前體。α-PGM的活力決定了G-6-P是更多的走向多糖合成路徑還是糖酵解途徑。而在糖酵解途徑中，PGI的活力決定了G-6-P能否更多的轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸(F-6-P)。據(jù)此，在灰樹(shù)花發(fā)酵培養(yǎng)液中加入天麻，通過(guò)檢測(cè)灰樹(shù)花代謝過(guò)程中關(guān)鍵酶酶活力的變化，初步研究了天麻與灰樹(shù)花代謝的相互影響。由于灰樹(shù)花多糖具有明顯的抗誘變、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、保肝護(hù)肝等生理活性作用，了解天麻成分對(duì)灰樹(shù)花多糖產(chǎn)量提高的機(jī)理對(duì)指導(dǎo)灰樹(shù)花多糖類(lèi)新藥制劑的研發(fā)具有重要的意義，并且藥食兩用真菌灰樹(shù)花通過(guò)轉(zhuǎn)化天麻中的有效成分，有可能獲得藥用活性更強(qiáng)、更穩(wěn)定的活性產(chǎn)物，活性產(chǎn)物的篩選工作正在進(jìn)行當(dāng)中。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

天麻(Gastrodia tuber) 貴州省德江縣天麻基地。

灰樹(shù)花菌株(51616) 中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；天麻素標(biāo)品 貴州迪大科技生物有限公司；葡萄糖 天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)；蛋白胨 上海盛思生化科技有限公司；KH2PO4天津市福晨化學(xué)試劑廠(chǎng)；MgSO4·7H2O 天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；無(wú)水乙醇 成都金山化學(xué)試劑有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(β-NADP)、磷酸鹽緩沖液(TEA-HCl)、乙二胺四乙酸(EDTA)、葡糖-6-磷酸脫氫酶(glucose 6-phosphate dehydrogenase) 美國(guó)Sigma公司；Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒、PGI、α-PGM活力定量試劑盒 貴州生物有限公司；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CP114電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司；TS-2102C恒溫振蕩器 上海天呈儀器有限公司；SPX-150B-Z恒溫培養(yǎng)箱、G Z X-9 0 7 0 M B E 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱、BXM-30R立式滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；TG2-16G低速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；UV-7502PC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海欣茂儀器有限公司；SW-CJ-1D凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 斜面種子培養(yǎng)

從母種試管中切取出黃豆粒大小的菌絲塊，接種于斜面中部。于25℃恒溫培養(yǎng)9d。

1.3.2 液體種子培養(yǎng)

將培養(yǎng)好的斜面菌種切取蠶豆大小，接于液體培養(yǎng)基中，250mL三角瓶裝液量100mL，25℃、150r/min，搖床培養(yǎng)9～11d。

1.3.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

按15%的接種量取液體種子進(jìn)行接種，250mL三角瓶裝液量100mL，25℃、150r/min搖床培養(yǎng)6～7d。

1.3.4 天麻醇提液的制備

稱(chēng)取一定量的天麻，加10倍量95%乙醇浸提48h，過(guò)濾后減壓蒸餾除去乙醇。用蒸餾水定容至適當(dāng)體積(天麻質(zhì)量濃度以生藥量計(jì))。靜置24h后過(guò)濾，濾液用于添加在灰樹(shù)花發(fā)酵培養(yǎng)基中。

1.3.5 生物量測(cè)定

將發(fā)酵液離心(4000r/min，20min)，用蒸餾水沖洗菌絲濾餅兩次，再離心，菌絲在90℃電熱恒溫干燥箱中烘干至質(zhì)量恒定，稱(chēng)質(zhì)量得菌絲生物量。

1.3.6 胞外多糖產(chǎn)量測(cè)定

將100mL發(fā)酵液經(jīng)4000r/min離心20min，得到的濾液用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)還原糖含量、苯酚-硫酸法測(cè)總糖含量。胞外多糖產(chǎn)量等于總糖含量與還原糖含量之差。

1.3.7 測(cè)定樣品的制備

分別取不同發(fā)酵時(shí)間的灰樹(shù)花發(fā)酵液于4000r/min離心15min，得到的菌絲體置于冷凍后的研磨中(研磨置于冰槽內(nèi))，加入裂解液，混勻，研磨充分后轉(zhuǎn)入5mL離心管中，加入強(qiáng)化液，渦旋振蕩15s，反復(fù)振蕩5次后，再加入適量裂解液于離心管中，于4℃、15000r/min離心15min。離心完成后取上清液至預(yù)冷的新的5mL離心管中。制得的上清液樣品用于后續(xù)測(cè)定。

1.3.8 α-PGM和PGI酶活力的檢測(cè)

蛋白含量的測(cè)定方法為Bradford法[13]，以牛血清白蛋白制標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線(xiàn)。

α-PGM反應(yīng)液中含有0.1mol/L TEA-HCl(pH7.6)、1.98mmol EDTA、0.127mmol β-NADP、5mmol MgCl2、1U葡糖-6-磷酸脫氫酶和一定量的細(xì)胞提取物。添加1.06mmol α-葡糖-1-磷酸后反應(yīng)開(kāi)始。葡糖磷酸異構(gòu)酶(PGI)反應(yīng)液中含有0.1mol/L 磷酸鉀緩沖液(pH7.2)、5mmol MgCl2、0.127mmol β-NADP、1U葡糖-6-磷酸脫氫酶和一定量的細(xì)胞提取物。添加1.06mmol果糖-6-磷酸后反應(yīng)開(kāi)始。

α-PGM、PGI酶活力定義為每分鐘每毫克蛋白中酶轉(zhuǎn)化1μmol NADPH為一個(gè)單位，故將酶活力單位定為μmol NADPH/(min·mg)。而NADPH的變化可在340nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度的改變來(lái)反映[14]。

兩種酶酶活力的計(jì)算公式為：

式中：A1為吸光度起始讀數(shù)；A2為吸光度終讀數(shù)；V1為反應(yīng)液總體積/mL；m為樣品稀釋倍數(shù)；V2為加入樣品體積/mL；6.22為NADPH毫摩爾吸光系數(shù)；t為反應(yīng)時(shí)間/min；ρ為樣品蛋白質(zhì)量濃度/(mg/mL)。

2 結(jié)果與分析

2.1 天麻添加量對(duì)灰樹(shù)花發(fā)酵產(chǎn)EPS和生物量的影響

圖 1 天麻添加量對(duì)灰樹(shù)花胞外多糖和菌體生物量的影響Fig.1 Effect of the amount of Rhizoma gastrodiae on EPS production and dry cell biomass

在搖瓶培養(yǎng)基中加入適量的天麻，利用灰樹(shù)花強(qiáng)大的分解轉(zhuǎn)化能力，對(duì)天麻中的纖維、糖類(lèi)、蛋白質(zhì)等物質(zhì)加以利用?；覙?shù)花在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中可能對(duì)天麻中的主要成分天麻素進(jìn)行轉(zhuǎn)化利用，從而提高胞外多糖的產(chǎn)量。其他條件為葡萄糖30g/L、蛋白胨5.5g/L、KH2PO41.5g/L、MgSO40.75g/L。不同天麻添加量對(duì)灰樹(shù)花發(fā)酵的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。天麻的添加量對(duì)灰樹(shù)花胞外多糖的產(chǎn)生具有一定的促進(jìn)作用。當(dāng)天麻質(zhì)量濃度為7g/L時(shí)胞外多糖產(chǎn)量及菌體生物量均達(dá)到最大值，分別為3.91g/L和8.90g/L。與對(duì)照相比，胞外多糖產(chǎn)量增加了5.1%，通過(guò)方差分析顯著性P=0.0262，說(shuō)明了灰樹(shù)花胞外多糖產(chǎn)量的顯著增加。而天麻經(jīng)過(guò)醇提，可以排除天麻中多糖對(duì)本實(shí)驗(yàn)帶來(lái)的干擾。隨著天麻質(zhì)量濃度的升高，灰樹(shù)花菌體生物量隨之降低?？赡苁翘炻橹械哪承┏煞謱?duì)灰樹(shù)花菌絲的生長(zhǎng)產(chǎn)生了抑制作用。因此確定選擇添加天麻質(zhì)量濃度為7g/L為最佳。

2.2 天麻對(duì)灰樹(shù)花胞外多糖合成的影響

采用真菌-酵母磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、真菌-酵母磷酸葡萄糖變位酶活性光譜法定量檢測(cè)試劑盒分別測(cè)定磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖變位酶的酶活性，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖 2 PGI與α-PGM酶活力的動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)Fig.2 Time course of α-phosphoglucomutase (α-PGM) and phosphoglucose isomerase (PGI) activities during fermentation in the presence of Rhizoma Gastrodiae

由圖2可知，未添加天麻的灰樹(shù)花發(fā)酵組(對(duì)照組)的異構(gòu)酶活力隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)其活力逐漸上升，在發(fā)酵144h時(shí)其活力達(dá)到最大值，之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其活力逐漸下降。添加天麻的灰樹(shù)花發(fā)酵組(天麻組)的異構(gòu)酶活力在144h處達(dá)到最大值，90～162h范圍內(nèi)變化不大，說(shuō)明異構(gòu)酶活力在90h后與對(duì)照組相比受到一定的抑制。

總體上考察，天麻組異構(gòu)酶活力比對(duì)照組的低，天麻對(duì)異構(gòu)酶活力影響顯著(P＜0.05)，這可能是加入天麻醇提液后，醇提液中的天麻素主要成分或復(fù)合成分對(duì)灰樹(shù)花多糖合成代謝途徑中的糖酵解重要酶——PGI起抑制作用。對(duì)照組與天麻組的變位酶酶活力先均呈上升趨勢(shì)，隨后逐漸下降。兩者相比并無(wú)顯著差異(P＞0.05)，加入的天麻醇提液對(duì)變位酶并無(wú)顯著影響。這與Tang Yajie等[15]在靈芝胞外多糖合成相關(guān)酶活力研究中的結(jié)果相似。

3 討 論

目前提高灰樹(shù)花多糖產(chǎn)量的研究主要集中在灰樹(shù)花發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化及向培養(yǎng)基中添加適量的中藥。這些傳統(tǒng)的方法對(duì)提高灰樹(shù)花菌絲量和代謝產(chǎn)物是可行的，但本研究從另外的角度研究了中藥天麻對(duì)灰樹(shù)花胞外多糖合成的影響。

PGI是糖酵解途徑中的重要酶，其最終引導(dǎo)乳酸的生成；α-PGM是EPS合成相關(guān)的重要酶，它引導(dǎo)葡萄糖-6-磷酸向多糖合成代謝途徑方向進(jìn)行。Degeest等[16]的研究表明在嗜熱鏈球菌中PGM的活力與EPS的合成緊密相關(guān)。本研究在添加天麻的基礎(chǔ)上(與對(duì)照組相比)對(duì)PGM的酶活力分析可知灰樹(shù)花EPS的合成與PGM的酶活力可能存在一種正相關(guān)的關(guān)系。天麻組的GPI活力受到顯著抑制，即糖酵解途徑受到顯著抑制，這對(duì)于葡萄糖-6-磷酸向多糖合成途徑行進(jìn)是有利的。Tang Yajie等[15]在靈芝胞外多糖合成相關(guān)酶活力研究中表明采用乳糖流加法可以促進(jìn)靈芝EPS的產(chǎn)生，其代謝途徑中α-PGM活力提高(與對(duì)照組相比)，PGI活力下降(與對(duì)照組相比)，其研究還表明α-PGM活力與EPS的合成正相關(guān)。正如先前的報(bào)道[17]，并聯(lián)系前面提到的α-PGM酶活力的變化情況，PGI活力的提高能減少糖異生途徑(EPS合成途徑)的碳通量，不利于EPS合成。

綜合上述表明加入適量的天麻對(duì)灰樹(shù)花胞外多糖產(chǎn)量的提高具有促進(jìn)作用，天麻對(duì)PGI和PGM的影響機(jī)理如何，有待進(jìn)一步研究。對(duì)于高等真菌灰樹(shù)花在EPS合成與酶的關(guān)系上并沒(méi)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，希望本研究對(duì)進(jìn)一步研究EPS合成的規(guī)則及產(chǎn)量的提高有所幫助。

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