馮燕　康曉潔　黎春暉　聶敏海

[摘要] 目的 研究4-亞基硝氧喹啉（4NQO）誘發(fā)大鼠口腔黏膜癌變過程中細(xì)胞角蛋白19（CK19）和間隙連接蛋白43（Cx43）的表達(dá)，探討口腔黏膜癌變過程中CK19與Cx43的相關(guān)性。方法 利用4NQO誘導(dǎo)SD大鼠的口腔黏膜癌變，運(yùn)

用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)CK19、Cx43在口腔黏膜癌變過程中各階段的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果 在大鼠正常舌黏膜組織中，CK19陽性染色的細(xì)胞散在分布于黏膜基底層；隨著大鼠舌黏膜上皮異常增生程度的增加，CK19表達(dá)于黏膜基底上層；在口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）組織中，CK19陽性染色細(xì)胞分布在黏膜各層。CK19在正常舌黏膜、輕度上皮異常增生、中度上皮異常增生、重度上皮異常增生、OSCC組織中陽性表達(dá)率分別為30.00%、50.00%、58.33%、80.00%、91.67%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在正常舌黏膜中Cx43蛋白主要表達(dá)于大鼠舌黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上，上皮

的基底層、棘層和顆粒層呈陽性染色。隨著大鼠舌黏膜上皮異常增生程度的增加，Cx43的表達(dá)明顯下降。Cx43在正常舌黏膜、輕度上皮異常增生、中度上皮異常增生、重度上皮異常增生、OSCC組織中陽性表達(dá)率分別為100.00%、85.71%、66.67%、40.00%、33.33%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 在大鼠舌黏膜癌變過程中，CK19蛋白表達(dá)水平隨病變程度加重顯著升高，提示CK19與口腔上皮細(xì)胞的癌變有關(guān)；Cx43蛋白表達(dá)水平隨病變程度加重顯著下降，Cx43表達(dá)下降是口腔黏膜癌變的早期事件。CK19與Cx43蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，CK19和Cx43的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)OSCC的早期診斷有重要的作用，有利于提高OSCC早期診斷的靈敏度和特異性。

[關(guān)鍵詞] 口腔鱗狀細(xì)胞癌； 細(xì)胞角蛋白19； 間隙連接蛋白43； 免疫組織化學(xué)

[中圖分類號(hào)] R 739.8 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.03.006

口腔癌發(fā)病率居頭頸部惡性腫瘤的第二位，其中90%以上為鱗狀細(xì)胞癌，5年生存率為50%[1]。早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療是目前提高口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）患者生活質(zhì)

量和生存率的關(guān)鍵所在。細(xì)胞角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）為Ⅰ型角蛋白，主要表達(dá)于單層上皮的上皮細(xì)胞，也散在表達(dá)于復(fù)層鱗狀上皮的基底層細(xì)胞[2-3]。其在口腔頜面部多種病變中均有表達(dá)，但是

口腔中的研究多局限于檢測(cè)不同分化程度鱗癌組織中CK19的表達(dá)變化，缺乏對(duì)其在口腔黏膜癌前病變的動(dòng)態(tài)研究。該蛋白能否作為早期診斷OSCC的指標(biāo)未進(jìn)行深入研究，也未得出一致結(jié)論。

在腫瘤細(xì)胞以及轉(zhuǎn)化細(xì)胞普遍存在細(xì)胞間隙連接通訊（gap junctional intercellular communication，

GJIC）的缺陷[4]，在細(xì)胞間隙連接蛋白（connexin，Cx）家族中Cx43分布最為廣泛，受到了廣泛關(guān)注和深入研究。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Cx43蛋白在多種正常組織中高表達(dá)，但在相應(yīng)的癌組織中出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)、異位表達(dá)或表達(dá)缺失[5-8]。GJIC缺陷與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但與口腔黏膜癌變的相關(guān)性的研究資料較少。

本文通過觀察CK19和Cx43在SD大鼠口腔黏膜癌變過程中的表達(dá)，從而探尋CK19和Cx43與口腔黏膜癌變的關(guān)系及意義。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本

隨機(jī)選取58只雄性SD大鼠，3～4只一籠同室飼養(yǎng)，均用常規(guī)飼料喂養(yǎng)。分為實(shí)驗(yàn)組（48只）和對(duì)照組（10只）。實(shí)驗(yàn)組大鼠飲用水中加入4-亞基硝氧喹啉（4-nitroquinoline-1-oxide，4NQO）（40×10-6 mg·L-1）誘癌，分批處死，取舌體組織；對(duì)照組飲自來水，與最后一批實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物同時(shí)處死，取舌體組織。切取的組織包埋切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，由2位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師進(jìn)行病理診斷。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)病理診斷結(jié)果，對(duì)58例標(biāo)本進(jìn)行分組：正常黏膜組10例；輕度上皮異常增生組14例；中度上皮異常增生組12例；重度上皮異常增生組10例；OSCC組12例。

1.2 方法

采用免疫組織化學(xué)SP法來觀察CK19和Cx43在SD大鼠口腔黏膜癌變過程中表達(dá)的變化，染色過程中設(shè)陽性和陰性對(duì)照。CK19用已知陽性切片作為陽性對(duì)照，Cx43用已知陽性切片作為陽性對(duì)照，PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。兔抗大鼠CK19（M259）多克隆抗體和兔抗大鼠Cx43（S369）多克隆抗體、免疫組化試劑盒SP-9000 HistostainTM-Plus Kits和顯色試劑盒（即用型DAB顯色試劑盒）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 觀察方法和結(jié)果判定

觀察由本研究者在有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)生指導(dǎo)下完成。CK19陽性染色部位為細(xì)胞漿和細(xì)胞膜，以細(xì)胞漿和細(xì)胞膜中出現(xiàn)黃色或棕黃色著色為陽性染色；Cx43蛋白以細(xì)胞膜或細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野（400倍）計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，以確定每個(gè)視野的陽性率；取其平均值作為該例的陽性率，并判定細(xì)胞染色強(qiáng)度。綜合染色強(qiáng)度和陽性率進(jìn)行分析處理。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無著色為0，淡黃色為1，棕黃色為2，棕褐色為3；陽性細(xì)胞比例評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：<5%為0，5%～25%為1，26%～50%為2，51%～75%為3，>75%為4。2項(xiàng)結(jié)果相加記為標(biāo)記指數(shù)（labeling index，LI），并通過LI判斷表達(dá)強(qiáng)度和表達(dá)陽性率。<2為陰性（-），2～3為弱陽性（+），4～5為中度陽性（++），6～7為強(qiáng)陽性（+++）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間比較采用多個(gè)樣本比較的秩和檢驗(yàn)、多個(gè)樣本間兩兩比較的秩和檢驗(yàn)及2趨勢(shì)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CK19在大鼠舌黏膜癌變各階段組織中的表達(dá)

在大鼠正常舌黏膜組織中，CK19陽性染色的細(xì)胞散在分布于黏膜基底層，基底上層不表達(dá)；隨著大鼠舌黏膜上皮異常增生程度的增加，CK19表達(dá)于黏膜基底上層；在OSCC組織中，CK19陽性染色細(xì)胞分布在黏膜各層，浸潤到黏膜下組織的癌細(xì)胞也呈陽性染色（圖1）。

CK19在大鼠正常舌黏膜、上皮異常增生、鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)情況見表1。由表1可見，在正常舌黏膜、輕度上皮異常增生、中度上皮異常增生、重度上皮異常增生、OSCC組織中CK19陽性表達(dá)率分別為30.00%（3/10）、50.00%（7/14）、58.33%（7/12）、80.00%（8/10）、91.67%（11/12）。正常舌黏膜與重度上皮異常增生和OSCC，輕度上皮異常增生與重度上皮異常增生和OSCC，中度上皮異常增生與OSCC，兩兩組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001），說明正常舌黏膜、上皮異常增生和OSCC表達(dá)CK19差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著病變程度加重，CK19表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)，陽性率增加（2趨勢(shì)=10.771，P<0.05）。

2.2 Cx43在大鼠舌黏膜癌變各階段組織中的表達(dá)

在正常舌黏膜中Cx43蛋白主要表達(dá)于大鼠舌黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上，上皮的基底層、棘層和顆粒層呈陽性染色，在角質(zhì)層中未見其表達(dá)。隨著大鼠舌黏膜上皮異常增生程度的增加，Cx43蛋白的表達(dá)明顯下降；在OSCC組織中，Cx43陽性染色分布于癌細(xì)胞細(xì)胞漿以及鱗狀細(xì)胞癌組織中的角化珠內(nèi)（圖2）。

Cx43在大鼠正常舌黏膜、上皮異常增生、鱗癌組織中的表達(dá)情況見表2。由表2可見，在正常舌黏膜、輕度上皮異常增生、中度上皮異常增生、重度上皮異常增生、OSCC組織中的陽性表達(dá)率分別為100.00%（10/10）、85.71%（12/14）、66.67%（8/12）、

40.00%（4/10）、33.33%（4/12）。正常舌黏膜與中度上皮異常增生、重度上皮異常增生、OSCC，輕度上皮異常增生與重度上皮異常增生、OSCC，中度上皮異常增生與OSCC，兩兩組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明在正常舌黏膜、上皮異常增生和OSCC組織中Cx43表達(dá)隨著病變程度增加而顯著降低（2趨勢(shì)=15.536，P<0.001）。

2.3 大鼠舌黏膜癌變過程中CK19和Cx43的相關(guān)性

鼠舌黏膜癌變過程中CK19和Cx43的相關(guān)性見表3。Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)：在大鼠舌黏膜癌變各階段中CK19和Cx43的表達(dá)具有相關(guān)性，呈負(fù)相關(guān)（相

關(guān)系數(shù)r=-0.889，P=0.000），隨病變程度加重，Cx43表達(dá)下降，而CK19表達(dá)增強(qiáng)。

3 討論

OSCC是最常見的口腔惡性腫瘤，近年來OSCC的發(fā)病率有增多趨勢(shì)，而且發(fā)病年齡有減小趨勢(shì)，嚴(yán)重危害人類的健康與生命?？谇火つど掀ぎ惓Ｔ錾s有4%～16%的癌變率，所以對(duì)其發(fā)生演變的病因?qū)W研究尤為重要[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大鼠正常舌黏膜組

織中，CK19陽性染色的細(xì)胞散在分布于黏膜基底層，基底上層不表達(dá)；隨著大鼠舌黏膜上皮異常增生程度的增加，CK19表達(dá)于黏膜基底上層；在OSCC組織中，CK19陽性染色細(xì)胞分布在黏膜各層，浸潤到黏膜下組織的癌細(xì)胞也呈陽性染色。與其他研究[10-12]結(jié)

果相似。此外本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在正常舌黏膜、輕度上皮異常增生、中度上皮異常增生、重度上皮異常增生、OSCC組織中CK19陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明正常舌黏膜、上皮異常增生和OSCC表達(dá)CK19差異有顯著性，隨著病變程度加重，CK19陽性率顯著增加，表達(dá)強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，與其他研究[11]結(jié)果相似；OSCC組與正常舌黏膜、輕度上皮異常增生、中度上皮異常增生組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，重度上皮異常增生組與正常舌黏膜、輕度上皮異常增生組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。目前的研究也表明CK19可能和癌基因有關(guān)，如在早期宮頸癌、肺癌、甲狀腺乳頭狀微小癌中可出現(xiàn)腫瘤微轉(zhuǎn)移，此時(shí)CK19與正常組織就已出現(xiàn)表達(dá)差異。

在Cx家族中Cx43分布最為廣泛，受到了廣泛關(guān)注和深入研究。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Cx43蛋白主要表達(dá)在大鼠舌黏膜上皮角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞膜，在正常舌黏膜上皮的基底層呈弱陽性染色，棘層和顆粒層呈強(qiáng)陽性染色，角質(zhì)層陰性染色，這種表達(dá)規(guī)律與其他研究[5-8]結(jié)果相似。由此推斷Cx43的表達(dá)分布情況可能與細(xì)胞的分化程度相關(guān)；Cx43可能是口腔黏膜早期癌變的一種生物標(biāo)志物。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)隨著大鼠舌黏膜上皮異常增生程度的增加，Cx43蛋白表達(dá)明顯下降；在OSCC組織中Cx43異位表達(dá)，分布在鱗癌細(xì)胞的胞漿及鱗癌組織中的角化珠。筆者推斷Cx43的分布狀態(tài)可能與細(xì)胞所處周期相關(guān)。在DNA合成期，Cx43既位于胞漿又分布在胞質(zhì)囊泡和其他胞內(nèi)間隔；在分裂期，Cx43幾乎全部位于胞漿，并呈分散的點(diǎn)狀積聚[7]，而舌癌

組織中的癌細(xì)胞正好處于快速分裂增殖期。許多免疫組織化學(xué)研究已證實(shí)Cx43蛋白表達(dá)的量與GJIC的能力密切相關(guān)，Cx43表達(dá)的下降意味著GJIC功能的下降。本研究動(dòng)態(tài)觀察了Cx43在4NQO誘導(dǎo)的SD大鼠舌黏膜從正常-輕度上皮異常增生-中度上皮異常增生-重度上皮異常增生-鱗狀細(xì)胞癌這一動(dòng)態(tài)癌變過程中的表達(dá)變化，Cx43表達(dá)強(qiáng)度的變化在正常舌黏膜與輕度上皮異常增生組織的比較中無明顯差異；但隨著癌變程度增加而顯著降低，差異有顯著性。證實(shí)了Cx43表達(dá)異常可以發(fā)生在癌變的各個(gè)階段，提示在大鼠舌黏膜癌變?cè)缙诎l(fā)生了Cx43表達(dá)下調(diào)。因此筆者推斷Cx43表達(dá)下調(diào)可能是口腔黏膜癌變過程的早期事件，與口腔黏膜癌變的發(fā)生密切相關(guān)。

細(xì)胞角蛋白是細(xì)胞骨架體系中性質(zhì)最為穩(wěn)定的組分，在細(xì)胞質(zhì)中起支架作用，對(duì)維持上皮細(xì)胞的形態(tài)和連續(xù)性起重要作用，與細(xì)胞分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、遷移、轉(zhuǎn)化、凋亡、基因調(diào)控等生命活動(dòng)相關(guān)；而GJIC是相鄰細(xì)胞間直接交換信息、物質(zhì)和能量的唯一通道，是維持多細(xì)胞組織穩(wěn)定必不可少的調(diào)節(jié)機(jī)制。GJIC是通過細(xì)胞間隙連接（gap junction，GJ）實(shí)現(xiàn)的，其基本組成單位是跨膜的Cx，Cx43是一種主

要的細(xì)胞間隙連接蛋白，Cx43組成的連接子在質(zhì)膜上常成簇出現(xiàn)形成間隙連接斑，同樣作為維持細(xì)胞穩(wěn)定的成分，兩者的表達(dá)是否有相關(guān)性呢？本研究發(fā)現(xiàn)：在大鼠舌黏膜癌變發(fā)展中CK19、Cx43蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。隨著病變程度加重Cx43表達(dá)下降，而CK19表達(dá)增強(qiáng)，推測(cè)鱗狀細(xì)胞癌組織中Cx43下降使得Cx表達(dá)減少，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和種植增加，因而使得檢測(cè)上皮細(xì)胞及上皮起源腫瘤微轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物CK19表達(dá)增多，為鱗狀細(xì)胞癌早期診斷及預(yù)后判斷提供依據(jù)。CK19和Cx43的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)OSCC的早期診斷有重要的指導(dǎo)作用，有利于提高OSCC早期診斷的靈敏度和特異性。

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（本文編輯 杜冰）