孟賀　丁潔　李任　梁銳英　吳文慧

[摘要] 目的 研究4種不同牙科金屬材料（金合金、銀鈀合金、鈷鉻合金、鎳鉻合金）浸提液對小鼠成纖維細胞

L929凋亡相關基因及蛋白表達的影響。方法 以金合金（A組）、銀鈀合金（B組）、鈷鉻合金（C組）、鎳鉻合金（D組）的浸提液體外培養(yǎng)小鼠成纖維細胞L929，并以含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基作為陰性對照（E組）。采用逆轉

錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法檢測了4種牙科金屬材料浸提液對L929細胞凋亡相關基因caspase-3、8、9 mRNA和蛋白表達的影響。結果 4種牙科金屬材料浸提液培養(yǎng)小鼠L929細胞48 h后，除A組與E組間差異無統(tǒng)計學意義外，各組間caspase-3 mRNA及caspase-9 mRNA表達差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。各組間caspase-8 mRNA差異無統(tǒng)計學意義。除A組與C組、B組與D組間差異無統(tǒng)計學意義外，caspase-3及caspase-9蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義，各組間caspase-8蛋白差異無統(tǒng)計學意義。結論 4種牙科金屬材料，除金合金外，均誘導小鼠成纖維細胞L929凋亡相關基因表達增加，金屬離子可能通過線粒體通路誘導細胞凋亡。

[關鍵詞] 牙科金屬； 浸提液； 成纖維細胞L929； 凋亡； 免疫組織化學

[中圖分類號] R 783.1 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.03.007

目前牙科合金材料的的強度、硬度、韌性和耐磨性等力學性能比較優(yōu)越，已經(jīng)成為口腔臨床中重要的修復材料。按照組成合金主要元素的價值可以分為貴金屬合金和非貴金屬合金兩大類[1-2]。應用于口腔中的貴金屬合金（如金合金等）和非貴金屬合金（如鎳鉻合金等）在細胞水平上均顯示出良好的生物相容性。然而，口腔環(huán)境復雜且金屬修復體在口腔環(huán)境中行使功能是一個長期的過程，口腔微生物可以通過多種途徑對材料產(chǎn)生腐蝕[3]。材料腐蝕可引起金屬離子釋放，如釋放的金屬離子達到一定的濃度后可能會導致局部或全身的損害[4]。有研究顯示金合

金離子析出量相對較少，耐腐蝕性能相對較好；而鎳鉻合金的耐腐蝕性能尚不夠理想，鎳離子可以改變牙齦成纖維細胞的形態(tài)、生存和增殖能力[5-6]。因此，生物相容性在義齒的材料選擇中將越來越受到重視。從整體、細胞和分子水平上評價材料的生物相容性是生物材料評價的發(fā)展趨勢和最終目的[7]。

本研究應用逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse trans-cription-polymerase chain reaction，RT-PCR）及免疫組化的方法在分子水平上對4種牙科合金（金合金、銀鈀合金、鈷鉻合金、鎳鉻合金）材料浸提液培養(yǎng)48 h的L929細胞天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（cas-

pase）-3、8、9 mRNA及蛋白表達進行檢測，在分子水平上探討金屬離子與細胞凋亡的關系。

1 材料和方法

1.1 細胞株

小鼠成纖維細胞L929由中國醫(yī)科大學中心實驗室提供。

1.2 試劑和儀器

RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），胎牛血清（TBD公司，天津），RT-PCR試劑盒（TAKARA公司，日本），總RNA提取劑（杭州博日公司），二甲基亞砜

（AMRESCO公司，美國），兔抗鼠caspase-3多克隆抗

體、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG（北京博奧森公

司），免疫組化試劑盒（PV6001，北京中杉金橋有限

公司），細胞培養(yǎng)箱（HERA Cell 150，Heraeu公司，

德國），高速離心機（DUPONT公司，美國），倒置相

差顯微鏡（Olympus公司，日本），恒溫水浴鍋（Grant

公司，英國），聚合酶鏈反應（polymerase chain reac-

tion，PCR）儀（Biometra公司，德國），電泳儀（北京市六一儀器廠）。

1.3 實驗分組及浸提液制備

將實驗材料分為金合金（A組）、銀鈀合金（B組）、鈷鉻合金（C組）、鎳鉻合金（D組）4個實驗組，每組樣

本量均為8個。4種牙科合金的組成見表1。制作半徑為5 mm、厚為1 mm的圓形蠟片，根據(jù)不同合金的要求鑄造形成圓形金屬片，打磨拋光后超聲清洗15 min，

去離子水沖洗數(shù)遍后置于玻璃小瓶中，將金屬片于121 ℃高壓滅菌后置于24孔板中。每孔加2 mL含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，同時設立陰性對照組（E組，即2 mL含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液），在37 ℃、5%CO2條件下連續(xù)浸提7 d后待用[8]。

1.4 RT-PCR檢測caspase-3、8、9 mRNA的表達

4種牙科金屬材料浸提液及E組培養(yǎng)液培養(yǎng)對數(shù)生長期的L929細胞48 h，按BIOZOL說明書提取RNA。依照小鼠GAPDH與caspase-3、8、9 的cDNA序列，采用Primer Premier 5引物設計軟件設計引物序列（表2）。按RT-PCR試劑盒操作說明書進行逆轉錄反應，逆轉錄反應條件為42 ℃ 30 min、99 ℃ 5 min、5 ℃ 5 min。PCR中caspase-3和caspase-8的復性溫度為55 ℃，caspase-9的復性溫度為58 ℃。取PCR產(chǎn)物5 μL與Genefinder和6×Loading buffer預染液1 μL混合后，上樣于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳液為1×TAE，電壓為100 V，40 min后在紫外燈凝膠成像系統(tǒng)下觀察結果，分析灰度值。

1.5 免疫組化反應檢測caspase-3、8、9蛋白表達

將對數(shù)生長期的L929細胞以濃度為每毫升6×104個接種于放有蓋玻片的6孔板，24 h細胞貼壁后棄去原培養(yǎng)基，加入不同浸提液培養(yǎng)48 h。棄上清液，0.1 mol·mL-1 PBS清洗5 min×3，95%乙醇室溫固定10 min，0.1 mol·mL-1 PBS清洗5 min×3。取出細胞爬片，晾干，用中性樹膠黏于載玻片上，PBS沖洗細胞爬片，3%過氧化氫室溫靜止10 min阻斷內源性過氧化物酶的活性，0.1 mol·mL-1 PBS清洗5 min×3。加入0.3%Triton-100，室溫30 min，增加細胞的通透性，0.1 mol·mL-1 PBS清洗5 min×3。加50 μL一抗（1∶200），陰性對照用PBS代替一抗，放置于濕盒中4 ℃過夜，0.1 mol·mL-1 PBS清洗5 min×3。加50 μL的二抗，室溫孵育40 min，0.1 mol·mL-1 PBS清洗5 min×3。加DAB溶液顯色3 min。自來水沖洗，蘇木素復染3 min，鹽酸乙醇分化，自來水沖洗10 min，梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察并拍攝照片。每張切片隨機選取3個視野，caspase-3、8、9在細胞質中呈棕黃色染色為陽性表達，以細胞未著色或輕微著色為陰性。在高倍鏡（×400）下拍攝照片，

應用Image Pro Pluss 6.0圖像分析系統(tǒng)測平均光密度（optical density，OD）值，對各組切片的caspase-3、8、9表達強度進行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，數(shù)據(jù)以x±s表示，對caspase-3、8、9 mRNA及蛋白的表達進行單因素方差分析及最小顯著差異（least signi-ficant difference，LSD-t）檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RT-PCR檢測結果

5組L929細胞caspase-3、8、9 mRNA凝膠電泳結果見圖1，相對灰度值（各組灰度值與GAPDH灰度值比值）的測量結果見表3。采用單因素方差方法分析各組灰度值，結果顯示caspase-3 mRNA與caspase-9 mRNA的表達差異顯著（F值分別為156.337、100.216，P<0.05）；LSD-t檢驗顯示除A組與E組間差異無統(tǒng)計學意義外，其余各組間差異顯著（P<0.05）。各組cas-pase-8 mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義（F=0.880，P>

0.05）。

2.2 免疫組化檢測結果

各組OD值的檢測結果見表4。由表4可見，cas-pase-3蛋白及caspase-9蛋白的表達差異顯著（F值分別為195.05、745.83，P<0.05）；LSD-t檢驗顯示除A組與C組、B組與D組間差異無統(tǒng)計學意義外，其余各組間差異顯著（P<0.05）。caspase-8蛋白表達差異無

統(tǒng)計學意義（F=0.593，P>0.05）。B組和D組caspase-3和caspase-9呈陽性表達，各組caspase-8呈陰性表達（圖2～4）。

3 討論

牙科合金修復體長期處在唾液這一電解質環(huán)境中會發(fā)生不同程度的腐蝕，導致金屬離子析出。如果這些離子超過一定的濃度，將對細胞造成損害。材料與機體短期或長期的接觸而導致的細胞形態(tài)學變化是以往評價材料生物相容性的主要內容和方法。如果生物材料對機體的影響已經(jīng)在整體水平和細胞水平上表現(xiàn)出來，那么在分子水平的基因表達方面勢必已經(jīng)造成影響，并且會極靈敏地反映出來。對于修復體材料析出的金屬離子可能對口腔細胞和組織形成不良刺激的問題在醫(yī)學界已基本達成共識，但直至2003年Faccioni等[9]和2004年Cortizo等[10]的研究報道揭示了修復體中析出金屬離子對口腔黏膜細胞和成骨樣細胞的DNA損傷和誘導凋亡作用，人們才開始在分子水平上探討金屬離子造成口腔組織不良刺激反應的作用機制。有研究[11-12]顯示：金屬離子

引起細胞死亡的方式主要是凋亡，有濃度依賴性和時間依賴性。caspases家族是細胞凋亡過程中的必需要素，caspase-3為caspase家族中的凋亡執(zhí)行因子，被認為是細胞凋亡過程中的關鍵酶之一。正常情況下，胞質中caspase-3以單體、微量、無或低活性的前caspase-3形式存在，當細胞發(fā)生凋亡時，其變?yōu)橛谢钚缘腸aspase-3。caspase-8與caspase-9分別參與死亡受體通路誘導的凋亡和線粒體通路誘導的凋亡。以往研究[13]表明4種牙科合金的細胞毒性為0級，均顯

示出良好的生物相容性。本研究在RT-PCR實驗中發(fā)現(xiàn)4種牙科合金caspase-3 mRNA與caspase-9 mRNA表達水平在各組間差異顯著，在免疫組化實驗中也發(fā)現(xiàn)4種牙科合金caspase-3與caspase-9蛋白表達水平差異顯著，其中金合金與鈷鉻合金差異無統(tǒng)計學意義，鎳鉻合金與銀鈀合金差異無統(tǒng)計學意義。牙科合金引起細胞凋亡相關基因的表達變化差異，可能是由于在口腔這一復雜的電解質環(huán)境中，不同合金的化學穩(wěn)定性不同所致。目前對鎳的致敏性和致癌性已有比較趨于一致的認識[14]。以往的研究[15-16]

表明：鎳離子可導致DNA的合成與復制受到抑制、改變DNA結構、降低蛋白質合成并影響堿性磷酸酶活性等一系列生物效應，鎳鉻合金可以導致DNA損傷并引起細胞凋亡。本實驗中，D組caspse-3 mRNA及蛋白表達均增高。雖然銀鈀合金為半貴金屬材料，但鈀能和氯、硫等反應，形成氯化物和硫化物，這種以離子形式存在的鈀能引起不良的生物學反應[17]。另外，關于鈀的致敏性和致癌性也有報道[18]。本研

究中發(fā)現(xiàn)銀鈀合金對caspase-3及caspase-9基因及蛋白表達的影響與金合金及陰性對照組差異顯著，其

中對凋亡相關蛋白表達的影響與鎳鉻合金無明顯差異。相反，鈷鉻合金作為非貴金屬材料對caspase-3及caspase-9基因的表達僅次于金合金及陰性對照組，而對caspase-3及caspase-9蛋白表達的影響與金合金及陰性對照組無顯著差異?？赡苁怯捎谄洳缓墟囋囟休^高比例的鉻元素，鉻元素的增加可減少金屬離子的析出，減少細胞毒性，并且在鈷鉻合金的表面可以形成Cr-O和Cr-OH結構的鈍化膜，阻止鈷和鉻的析出[19]。

細胞凋亡是一個精細的調節(jié)過程，本研究發(fā)現(xiàn)4種牙科合金在轉錄水平上誘導caspase-3及caspase-9 mRNA表達增高，并且各組間差異顯著。在翻譯水平上金合金與鈷鉻合金未發(fā)現(xiàn)對caspase-3及caspase-9蛋白的表達有顯著誘導作用，而銀鈀合金與鎳鉻合金誘導caspase-3及caspase-9蛋白表達增高，這與轉錄水平上的結果并不完全一致?？赡苓€存在其他抑制凋亡蛋白表達的途徑或通路同時發(fā)揮作用。唾液環(huán)境復雜，金屬離子在培養(yǎng)基中的情況也不能完全代表在唾液中的真實情況，這些問題都需要進一步研究。另外，各組間caspase-8 mRNA及蛋白表達均無顯著差異，進一步提示金屬離子可能通過線粒體通路誘導細胞凋亡。希望這一現(xiàn)象能為將來在分子水平上檢測材料的生物相容性提供實驗依據(jù)。

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（本文編輯 杜冰）