金河田，王曉旭，樸豐源

(1.沈陽202醫(yī)院 放射治療中心，遼寧 沈陽 116001；2.大連醫(yī)科大學(xué) 勞動衛(wèi)生與環(huán)境學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)

亞慢性砷暴露對小鼠海馬組織細胞凋亡的影響

金河田1，王曉旭2，樸豐源2

(1.沈陽202醫(yī)院 放射治療中心，遼寧 沈陽 116001；2.大連醫(yī)科大學(xué) 勞動衛(wèi)生與環(huán)境學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

目的觀察亞慢性砷暴露致小鼠海馬組織細胞凋亡作用，為探討砷的神經(jīng)毒性作用機制提供依據(jù)。方法昆明種小鼠40只，按體重將小鼠隨機分為對照組、1 ppm、2 ppm 和4 ppm 三氧化二砷 (As2O3) 染毒組。通過自然飲用含不同濃度As2O3水的方式使小鼠砷暴露，連續(xù)染毒60 d。取海馬組織，通過HE染色觀察海馬組織形態(tài)學(xué)變化，通過TUNEL和Hoechst雙染以及透射電鏡觀察神經(jīng)細胞凋亡。結(jié)果與對照組相比，染毒組小鼠的海馬神經(jīng)細胞出現(xiàn)腫脹，細胞核仁增多，細胞分布稀疏、排列紊亂。電鏡下，可觀察到染毒組小鼠的海馬細胞出現(xiàn)膜皺縮，核仁消失，染色質(zhì)凝聚、移動，分布于核周，進而裂解成幾個碎片等凋亡細胞形態(tài)特征。TUNEL和Hoechst雙染色分析結(jié)果顯示，在染毒組小鼠海馬切片可見凋亡染色陽性細胞，其凋亡指數(shù)顯著高于對照組(P<0.01)，且隨著染毒劑量的增高而增多。結(jié)論亞慢性砷暴露可導(dǎo)致小鼠海馬組織細胞凋亡。

三氧化二砷；海馬；凋亡；神經(jīng)毒性

砷的中樞神經(jīng)毒性日益受到國內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn), 長期飲用含砷水的兒童記憶力、注意力及語言能力均有不同程度的下降[1]。動物實驗也表明，長期染砷后大鼠的學(xué)習和記憶能力顯著低于對照組[2]。海馬是學(xué)習記憶的關(guān)鍵部位, 亦是毒物作用的敏感部位, 多種毒物誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元細胞發(fā)生凋亡均會造成學(xué)習記憶能力的損害[3]，然而砷暴露是否誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡文獻報道不多。本研究主要觀察亞慢性砷暴露對小鼠海馬組織細胞損傷及誘導(dǎo)凋亡的影響。通過三氧化二砷(As2O3)染毒小鼠制作亞慢性砷中毒動物模型，采用HE染色觀察砷對海馬神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)影響。用透射電鏡方法及TUNEL和Hoechst雙染法觀察染砷小鼠海馬神經(jīng)元發(fā)生凋亡情況，為探討砷的學(xué)習記憶損傷毒性機制提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

三氧化二砷 (As2O3)(上?；瘜W(xué)試劑廠)；In Situ Cell Death Detection Kit(羅氏，德國)；Recombinant DNase I(寶生物工程有限公司，中國)；Triton X-100 (Sigma，美國)；枸櫞酸鹽(天津制藥廠，中國)；防猝滅封片劑(碧云天生物有限公司，中國)，Hochest 染色劑(Sigma，美國)，TCS - SP2激光掃描共聚焦顯微鏡(Leica，德國)。

1.2 實驗動物分組及處理

SPF級昆明小鼠40只，雌雄各半，體重 (20±2)g，由大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號為SCXK(遼)2008-0002。小鼠按體重隨機分為 4 組，每組10只。即對照組、1 ppm As2O3染毒組、2 ppm As2O3染毒組、4 ppm As2O3染毒組。將不同濃度的As2O3溶解于飲用水中，通過自然飲用含不同濃度As2O3蒸餾水方式使小鼠暴露于As。飼養(yǎng)小鼠的室內(nèi)條件如室溫 (22±2)℃、濕度 (60±5)%等被嚴格監(jiān)控，小鼠可以任意飲水和取食(標準食物)，連續(xù)染毒60 d。

1.3 HE染色觀察

對照組和染毒組小鼠各3只，將小鼠用戊巴比妥納(200 mg/kg)在腹腔處麻醉，經(jīng)4%多聚甲醛溶液(pH7.4)灌流2 h。將用多聚甲醛固定后的海馬組織浸入石蠟中，從海馬中間部分開始以5 μm厚度切片，進行HE染色，鏡下觀察海馬組織形態(tài)學(xué)改變。Olympus顯微鏡下觀察照相。

1.4 透射電子顯微鏡觀察

取對照組和染毒組小鼠各3只，脫頸處死，在冰上迅速取出大腦，放在潔凈的培養(yǎng)皿上，快速分離出海馬，將海馬修整成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，放入預(yù)冷的2.5%戊二醛固定液中(4 ℃，pH7.4)固定2 h，然后取出組織塊，用緩沖液漂洗后改用1%鋨酸固定液固定2 h(4 ℃，pH7.4)。固定完后，進行丙酮梯度脫水。將組織常規(guī)包埋在多孔橡膠包埋模板中，修成小塊，超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，H-7500型透射電鏡觀察細胞凋亡情況，并拍照。

1.5 TUNEL-Hoechst凋亡雙染色

對照組和染毒組小鼠各4只，將小鼠用戊巴比妥納(200 mg/kg)在腹腔處麻醉，經(jīng)4%多聚甲醛溶液(pH7.4)灌流2 h。將小鼠置于冰上，取出腦組織，快速分離海馬組織，放入4%多聚甲醛溶液中固定。將固定好的組織進行石蠟包埋，切片機進行切片，每片5 μm厚，貼片待用。TUNEL染色采用 In Situ Cell Death Detection Kit(羅氏，德國)試劑盒，主要步驟：將切好的切片進行脫蠟浸水，將切片浸入到新配的孵育液中(0.1% Triton X-100, 0.1% sodium citrate)，25 ℃，8 min。切片浸入TUNEL反應(yīng)混合液中孵育，37 ℃，60 min；之后用Hoechst 33342 (2 mg/mL) 染色20 min。最后，用防猝滅封片劑封片，4 ℃，暗室，放置12 h，然后于共聚焦顯微鏡下檢測，并拍照。40倍光鏡下，隨機選擇10個視野并計數(shù)1000個海馬神經(jīng)元細胞，記錄凋亡細胞數(shù)。計算細胞凋亡指數(shù)(AI)，AI=(凋亡細胞數(shù)/1000)×100%。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

計量資料結(jié)果用均數(shù)±標準差形式表示，應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料的組間差異，采用χ2分析，以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠海馬細胞病理形態(tài)學(xué)觀察

對照組海馬神經(jīng)元細胞邊緣清晰，細胞核呈圓形、橢圓形，染色質(zhì)在核內(nèi)分布較均勻，核仁清晰(見圖1A)。而各染毒組可見海馬神經(jīng)元分布稀疏、排列紊亂，膜邊緣欠清晰，胞漿可見空泡變性，核固縮或碎裂，其中尤以4 ppm As2O3組最為嚴重(圖1B，C，D)。

2.2 透射電鏡觀察小鼠海馬細胞凋亡

電鏡下，對照組小鼠海馬細胞核膜核仁清晰可見，核內(nèi)染色質(zhì)均勻分布(圖2A)。而在染毒組小鼠的海馬組織可見凋亡細胞，細胞皺縮，核膜尚完整，核仁消失，染色質(zhì)凝聚、移動，分布于核周，進而裂解成幾個碎片(圖2C，D)。

2.3 TUNEL-Hoechst染色觀察小鼠海馬細胞凋亡

TUNEL-Hoechst凋亡染色觀察顯示，對照組和1 ppm As2O3染毒組在視野下幾乎見不到陽性細胞(圖3A，B)。2 ppm As2O3染毒組小鼠海馬切片中發(fā)現(xiàn)極少數(shù)的陽性細胞(圖3C)，而高劑量4 ppm As2O3染毒組海馬切片中，可見較多的TUNEL陽性細胞，有的散在分布，有的集中分布，凋亡細胞較多(圖3D)。各染毒組小鼠海馬細胞的凋亡指數(shù)分別為1 ppm組4.23±1.08,2 ppm組11.23±3.31，4 ppm組28.39±4.36，均顯著高于對照組0.23±0.08，P<0.01；且隨著染毒劑量的增高而增多(圖4)。

圖1 染砷小鼠海馬細胞病理形態(tài)學(xué)變化(HE×200)

圖2 染砷小鼠海馬凋亡細胞的透射電鏡觀察 (× 100 000)

圖3 TUNEL-Hoechst染色觀察染砷小鼠海馬細胞凋亡

圖4 凋亡指數(shù)分析

3 討 論

砷是一種分布廣泛的環(huán)境污染物，人體主要通過飲用含砷濃度超標的水以及職業(yè)的途徑砷暴露[4]。目前全世界估計近5 700萬人飲用的地表水中所含砷超過WHO所規(guī)定的標準，而中國是受砷中毒危害最為嚴重的國家之一[5]。砷暴露可引起多器官系統(tǒng)的疾病，其中砷致神經(jīng)系統(tǒng)損害而影響兒童記憶力及學(xué)習能力的問題尤其得到人們的高度關(guān)注。

細胞凋亡也稱為程序性細胞死亡，是一種由基因控制的細胞主動死亡過程。在一定程度上, 細胞凋亡對生物體維持自身穩(wěn)定具有重要作用，而細胞凋亡調(diào)控失常常參與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展。砷與細胞凋亡聯(lián)系密切，可誘導(dǎo)多種細胞發(fā)生凋亡，使組織喪失正常生理功能。陳偉等[6]發(fā)現(xiàn)，慢性砷染毒可誘發(fā)生精細胞凋亡，張韻等[7]發(fā)現(xiàn)，砷可通過誘導(dǎo)肝細胞凋亡，導(dǎo)致肝臟損傷。有研究報道，在染砷大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元和小腦神經(jīng)元觀察到具有凋亡特征性的形態(tài)學(xué)改變[8]。海馬結(jié)構(gòu)與生物的學(xué)習記憶有密切關(guān)系, 其結(jié)構(gòu)和功能的完整性對生物保持正常學(xué)習記憶有重要作用。本實驗光鏡和電鏡觀察結(jié)果顯示，亞慢性砷暴露引起海馬神經(jīng)元細胞發(fā)生異常形態(tài)學(xué)改變，同時發(fā)生凋亡細胞數(shù)增多并隨染砷劑量的加大而增加。本研究結(jié)果提示，亞慢性砷暴露可誘導(dǎo)小鼠海馬神經(jīng)元發(fā)生凋亡。砷的誘導(dǎo)凋亡作用很可能是慢性砷暴露導(dǎo)致兒童出現(xiàn)學(xué)習記憶下降的重要機制之一。

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Effectofsubchronicexposuretoarseniconapoptosisofhippocampuscellsinmice

JINHe-tian1,WANGXiao-xu2,PIAOFeng-yuan2

(1.CentreofRadiotherapy,the202HospitalofShenyang,Shenyang116001,China; 2.DepartmentofOccupationalandEnvironmentalHealth,CollegeofPublicHealth,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China)

ObjectiveTo examine the apoptosis of hippocampus cells in mice exposed to arsenic (As) subchronically and to provide evidences for exploring the mechanism of As-induced neurotoxicity.MethodsForty mice were divided into 4 groups of 10 each. Group 1

drinking water alone (control). Group 2, 3 and 4 received 1 ppm, 2 ppm and 4 ppm As2O3respectively. As2O3was given through drinking water. On the 60th day after As2O3exposure, mice were decapitated and the hippocampus was taken. Pathomorphological changes of hippocampus tissue were observed by optical microscope. Apoptosis of hippocampus cells was also examined by electron microscopy and TUNEL-Hoechst.ResultsCompared with control, swelling of hippocampus cells, sparse of cell distribution and disorder of cell arrangement where foswhd. Under transmission electron microscopy, some neurons in mice exposed to As showed a shrunken cellular membrane, diminished cell body and increased delectron density of nuclear chromatin. The apoptosis indices of the hippocampal neuron in the mice exposed to As were significantly higher than those in controls (P<0.01).ConclusionThe subchronic exposure to As may induce apoptosis of hippocampus cells in mice.

As2O3; hippocampus; apoptosis; neurotoxicity

10.11724/jdmu.2013.03.02

R114

A

1671-7295(2013)03-0214-04

金河田，王曉旭，樸豐源.亞慢性砷暴露對小鼠海馬組織細胞凋亡的影響[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013,35(3)：214-217.

國家自然科學(xué)基金(30571584)

金河田(1960-)男，遼寧沈陽人，副主任醫(yī)師。

樸豐源，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：piaofy_dy@yahoo.com.cn

2013-02-18；

2013-03-21)