亞細亞酸對兔未成熟肺缺血再灌注損傷的保護作用

閆憲剛 仇萬山 賈 兵

·論著·

亞細亞酸對兔未成熟肺缺血再灌注損傷的保護作用

閆憲剛 仇萬山 賈 兵

目的 觀察亞細亞酸對兔未成熟肺缺血再灌注損傷的保護作用。方法 選用15 ～ 21日齡新西蘭白兔60只，分為5組：假手術(shù)組，對照組，亞細亞酸低、中和高劑量組，每組各12只。建立單肺缺血再灌注模型，肺門阻斷1 h后，開放再灌注4 h。亞細亞酸低、中和高劑量組分別于術(shù)前3 d給予亞細亞酸7.5、15和30 mg·kg-1,假手術(shù)組僅開胸不阻斷肺門，對照組不予干預(yù)。術(shù)畢收集肺組織，光鏡和電鏡觀察肺組織病理和超微結(jié)構(gòu)改變。測定肺組織丙二醛(MDA)，細胞毒性活性氧(ROS)-HR、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)水平。Western Blot檢測髓樣生化因子(MyD)88和核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)水平。ELISA法檢測IL-1β、TNF-α水平。結(jié)果 ①亞細亞酸中和高劑量組肺缺血再灌注損傷明顯減輕，光鏡下肺泡與肺泡間隔腫脹程度明顯輕于對照組，肺泡腔滲液減少，出血少見。電鏡下可見肺泡上皮與血管內(nèi)皮細胞脫落明顯減少。②亞細亞酸中和高劑量組較對照組肺組織MDA，ROS-HR水平明顯降低，SOD及GSH-PX水平明顯升高；各時點的IL-1β、TNF-α水平也有不同程度下降，特別是再灌注后的2 h和4 h(P<0.05)；肺組織中MyD88和NF-κB表達顯著下降。③亞細亞酸中和高劑量的保護效果較好。結(jié)論 亞細亞酸對未成熟肺缺血再灌注損傷有一定的保護作用，其機制與清除氧自由基和減輕全身炎性反應(yīng)有關(guān)。

幼兔； 缺血再灌注; 肺損傷； 亞細亞酸

隨著外科技術(shù)和圍術(shù)期監(jiān)護技術(shù)的提高，先天性心臟病(CHD)的手術(shù)趨于低齡化，但體外循環(huán)心內(nèi)直視手術(shù)后肺缺血再灌注損傷，仍是臨床常見的并發(fā)癥，急性肺損傷的發(fā)生率為15%～30%[1]，重癥病死率達15% ～ 50%[2]。特別對于新生兒和嬰幼兒CHD術(shù)后未成熟肺缺血再灌注損傷的發(fā)生率更高，程度更嚴重，是影響預(yù)后的最常見因素[3，4]，因此肺保護一直是心臟外科領(lǐng)域的研究熱點之一。亞細亞酸(asiatic acid)是積雪草提取物中的五環(huán)三菇烯類組分，具有抗炎和抗損傷作用[5]。國外學者已證實亞細亞酸對腦局灶性缺血再灌注損傷有一定保護作用[6]，尚未見對未成熟肺保護作用的報道。故本研究建立幼兔肺缺血再灌注模型，觀察亞細亞酸是否可以減輕肺缺血再灌注損傷，探討一種新的針對未成熟肺的保護方法，為改善嬰幼兒CHD外科預(yù)后提供理論上的依據(jù)。

1 方法

1.1 實驗動物 相同遺傳背景的15～21日齡新西蘭兔60只(體重0.6～0.8 kg)，上海農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所提供，提前1周送至本研究動物實驗房喂養(yǎng)，以適應(yīng)環(huán)境(溫度22℃，濕度60%)。

1.2 分組和干預(yù) 分為5組：假手術(shù)組，對照組，亞細亞酸低、中和高劑量組，每組各12只。參照Skauma等[7]方法建立單肺缺血再灌注損傷模型：禁食12 h，戊巴比妥鈉15 mg·kg-1靜脈麻醉，左側(cè)臥位，經(jīng)右前外側(cè)切口，第5肋間進胸，顯露右側(cè)肺門，分離動脈、靜脈及支氣管。靜脈注射肝素200 U·kg-1，5 min后用18號小彎無損傷鉗，阻斷右肺門1 h后再開放。假手術(shù)組僅開胸，不阻斷肺門。亞細亞酸低、中和高劑量組分別于建模前3 d喂服亞細亞酸(純度95%，批號84696-21-9，廣西昌洲天然產(chǎn)物開發(fā)有限公司)7.5、15和30 mg·kg-1，對照組不給予干預(yù)。

1.3 觀察指標

1.3.1 炎性因子水平 各組于開放肺門(再灌注)前、開放(再灌注)后1、2和4 h采集血樣，ELISA法檢測各時點IL-1β和TNF-α水平，試劑盒由上海希美生物科技有限公司提供。

1.3.2 丙二醛(MDA)、細胞毒性活性氧(ROS)-HR、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)水平測定 各組于術(shù)畢收集右下肺葉，稱取肺組織200 mg，按重量體積比加入9倍的生理鹽水制成10%的組織勻漿，2500 r·min-1離心10 min，取上清液再用生理鹽水稀釋成0.1%的勻漿，ELISA法測定MDA、ROS、DOS和GSH-PX水平，試劑盒由南京建成生物研究所提供。

1.3.3 髓樣分化因子(MyD)88和核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)水平測定 各組于術(shù)畢收集右下肺葉，采用全細胞蛋白抽提試劑盒提取肺組織細胞內(nèi)蛋白。取50 μg 蛋白，95℃變性 5 min，以Western-blot法進行蛋白電泳，分別加入兔抗鼠 MyD88和NF-κB、Lamin B、β-actin一抗，4℃過夜；洗膜3次，加入 HRP 標記二抗，37℃孵育1 h，洗膜 3 次；用 Odyssey紅外熒光掃描機成像系統(tǒng)進行掃膜。采用Bandscan 5. 0軟件對蛋白條帶進行灰度值分析，以目的條帶與β-actin、Lamin B內(nèi)參照條帶的比值代表蛋白的表達水平。每一個條帶代表3次重復(fù)實驗的結(jié)果。

1.3.4 血流動力學指標和血氣指標 各組于缺血再灌注后2 h時點采集血樣，行血氣分析和血流動力學指標分析。

1.3.5 肺組織病理和超微結(jié)構(gòu)改變 各組取右肺下葉組織2塊，1塊以10%甲醛室溫下固定18 h，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，制成厚4 μm的切片，蘇木精-伊紅染色，光鏡觀察；另一塊組織快速固定于2.5%的冷戊二醛液2 h，1%鋨酸再固定1 h，丙酮梯度脫水，Epon-812樹脂包埋，半薄切片定位與肺泡結(jié)構(gòu)，70 nm超薄切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重電子染色，JEM-1200透射電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 死亡率 假手術(shù)組、對照組、亞細亞酸低、中和高劑量組分別有1、6、4、3和4只兔死亡。

2.2 各組肺組織MDA，ROS-HR水平比較 表1顯示，對照組ROS-HR和MDA水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，亞細亞酸中、高劑量組ROS-HR和MDA水平顯著低于對照組(P<0.05)；亞細亞酸低劑量組ROS-HR和MDA水平與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。亞細亞酸三個劑量組中，中劑量組ROS-HR和MDA水平最低。

2.3 各組肺組織SOD、GSH-PX水平比較 如表1所示，對照組肺組織線粒體SOD和GSH-PX水平顯著低于假手術(shù)組(P<0.05)，亞細亞酸中劑量組SOD水平和GSH-PX活性顯著高于對照組(P<0.05)，亞細亞酸低、高劑量組SOD水平和GSH-PX活性與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4 各組肺組織MyD88和NF-κB表達水平比較 圖1和表1顯示，對照組肺組織線粒體MyD88和NF-κB水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，亞細亞酸低、中、高劑量組MyD88和NF-κB水平顯著低于對照組(P均<0.05)。

2.5 各組血漿TNF-α和IL-1β水平比較 圖2顯示，對照組再灌注前、再灌注后1、2、4 h TNF-α和IL-1β水平均顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，于再灌注后2 h達峰值，之后略有下降。再灌注前：亞細亞酸低、中和高劑量組IL-1β水平顯著低于對照組，亞細亞酸中、高劑量組TNF-α水平顯著低于對照組(P<0.05)；再灌注后1 、2和4 h：亞細亞酸低、中和高劑量組IL-1β和TNF-α水平顯著低于對照組(P<0.05)。

圖1 MyD88和NF-κB電泳條帶

Fig 1 Electrophoresis strip of MyD8 and NF-κB in different groups

Notes 1: Sham group; 2 I/R group; 3 asiatic acid low dose group; 4 asiatic acid medium dose group; 5 asiatic acid high dose group

表1 各組MDA，ROS-HR、SOD、GSH-PX、MyD88和NF-κB水平比較

Notes 1)vssham group,P<0.05; 2)vsI/R group,P<0.05

2.6 各組再灌注2 h血流動力學和血氣指標比較 表2顯示，各組在體溫、肺局部溫度、Hb水平和血液pH值指標上差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。缺血再灌注2 h時點對照組與假手術(shù)組比較，血液動力學指標心率顯著減慢、動脈收縮壓、動脈舒張壓和平均壓顯著下降(P均<0.05)；外周血WBC顯著增高(P<0.05)；血氣指標PO2顯著下降，PCO2顯著升高(P<0.05)。

圖2 各組灌注前和灌注后不同時點TNF-α和IL-1β水平比較

Fig 2 Comparison of TNF-α IL-1βlevels before and after reperfusion at different time points in different groups

Notes Before reperfusion, the TNF-α IL-1βlevels of I/R group were siginificant higher than sham group(P<0.05). 1, 2 and 4 h after reperfusion, TNF-α and IL-1βlevel of asiatic acid low, middle and high dose group were siginificant lower than sham group(P<0.05)

亞細亞酸低、中、高劑量組與對照組相比，血流動力學指標心率顯著加快、動脈收縮壓、動脈舒張壓和平均壓顯著上升(P<0.05)；外周血WBC計數(shù)顯著降低(P<0.05)；血氣指標PO2顯著升高，PCO2顯著下降(P<0.05)，上述指標不同劑量亞細亞酸組間無顯著差異(P>0.05)，與假手術(shù)組差異也無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.7 各組肺組織病理學改變 假手術(shù)組光鏡下可見肺泡清晰，結(jié)構(gòu)完整，無塌陷，無腫脹或滲液(圖3A)；對照組可見肺組織微血栓阻塞毛細血管，較多白細胞侵潤，肺泡細胞與間隔組織腫脹明顯，肺泡腔內(nèi)有較多滲液，部分肺泡腔塌陷(圖3B)；亞細亞酸低劑量組肺組織損傷較對照組略有改善，可見白細胞侵潤，肺泡和間隔組織腫脹明顯，肺泡腔內(nèi)較多滲液，間質(zhì)炎細胞多見(圖3C)；亞細亞酸中、高劑量組肺組織損傷明顯好轉(zhuǎn)，可見肺泡細胞與間隔組織輕微腫脹，肺泡腔內(nèi)滲液消失，少見微血栓阻塞毛細血管，無明顯白細胞侵潤，少部分肺泡腔略塌陷(圖3D,E)。

假手術(shù)組電鏡下可見肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，上皮細胞及其游離面有少量的微絨毛清晰，基底膜完整，細胞核較大，居中，線粒體圓或橢圓，核糖體豐富，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)短桿狀，細胞質(zhì)內(nèi)有大量的板層小體(圖4A)；對照組可見上皮細胞腫脹，線粒體腫脹電子密度降低、局灶性空化變性，嵴消失、破裂，基底膜菲薄，吞飲小泡增多，表面微絨毛形成指狀突起，基底膜水腫、增厚(圖4B)；亞細亞酸低劑量組肺組織電鏡結(jié)構(gòu)較對照組略有改善，細胞結(jié)構(gòu)模糊、排列尚規(guī)整，吞飲小泡存在，仍有空化變性，基底膜水腫、增厚(圖4C)；亞細亞酸中、高劑量組可見肺泡結(jié)構(gòu)存在，細胞器略減少，但結(jié)構(gòu)相對正常，線粒體無明顯腫脹，無明顯空化變性，無空化變性，嵴存在，間質(zhì)血管略充血，可見間質(zhì)炎細胞，間質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)上清晰、排列尚規(guī)整(圖4D,E)。

表2 各組再灌注2 h時點血液動力學和血氣指標比較

Notes 1)vssham group,P<0.05; 2)vsI/R group,P<0.05

圖3 各組肺組織光鏡下所見(HE staining, ×100)

Fig 3 Findings under light microscope of lung tissue in 5 groups(HE staining, ×100)

Notes A: sham group showed the normal lung structure; B: I/R group showed remarkable alveolar and interstitial edema, alveolar space collapse, infiltrated inflammatory cells, and detached epithelial cells; C: asiatic acid low dose group showed slightly decreased alveolar and interstitial edema; D,E: asiatic acid middle and high dose group showed obviously decreased alveolar and interstitial edema, alveolar space collapse and detached epithelial cells

圖4 各組肺組織電鏡下所見(×10 000)

Fig 4 Findings under transmission electron microscope of lung tissue in 5 groups(×10 000)

Notes A: sham group showed the normal lung structure; B: I/R group showed swollen, vacuolated and near-broken mitochondria; C: asiatic acid low dose group showed slightly improvement of mitochondria; D,E: nearly normal appearance of mitochondria

3 討論

目前認為肺缺血再灌注損傷和全身炎癥反應(yīng)是體外循環(huán)相關(guān)性肺損傷最主要的發(fā)生機制[8]。在肺動脈恢復(fù)灌注后，大量氧和血進入肺臟，產(chǎn)生大量氧自由基、炎癥因子和細胞酶類，導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮細胞廣泛受損，通透性增加，導(dǎo)致肺缺血/再灌注損傷。晚近有研究報道，嬰幼兒器官組織抗氧化能力較低，更易受到氧化應(yīng)激的侵害[7,9～11]。本研究前期證實了未成熟兔肺更容易發(fā)生缺血再灌注損傷，且損傷程度和時間均較成熟兔更為嚴重[11]。

ROS和MDA是反映組織的損傷指標，MDA體現(xiàn)機體細胞氧化損傷的程度。缺血再灌注可導(dǎo)致SOD水平和活性下降，ROS過度釋放，MDA水平增高，血循環(huán)TNF-α、IL-1β水平升高[13]，線粒體功能下降，組織細胞死亡。本研究顯示15～21日齡兔建立的缺血再灌注模型可觀察到上述指標的變化，提示建模成功。

亞細亞酸具有抗炎、抗氧化、保護線粒體及抗細胞凋亡等作用[14～16]。Gao等[17]研究顯示，亞細亞酸可清除超氧負離子和羥基，劑量依賴性抑制鈣離子誘導(dǎo)的線粒體溶脹，保護肝線粒體。Tabassum等[6]研究顯示，亞細亞酸可改善缺血再灌注后大鼠的異常行為，縮小腦梗死范圍，增高組織SOD和GSH-PX水平。Huang等[18]研究角叉菜膠誘發(fā)大鼠足趾炎性痛模型顯示，亞細亞酸可增高SOD和GSH-PX活性，降低NF-κB的表達。本研究顯示，給予亞細亞酸干預(yù)后，幼兔肺組織SOD、GSH-PX升高，ROS下降，其中以中、高劑量組效果為著；同時缺血再灌注后2、4 h時點血漿TNF-α和IL-1β水平顯著降低；提示一方面亞細亞酸可能通過提高肺組織的抗氧化能力和降低氧自由基的產(chǎn)生，另一方面通過降低機體炎癥反應(yīng)，改善了缺血再灌注后的肺損傷。同時亞細亞酸干預(yù)組的MyD88和NF-κB表達也顯著下降，提示炎癥反應(yīng)的降低可能與其傳導(dǎo)通路上MyD88和NF-κB表達下調(diào)有關(guān)。亞細亞酸對缺血再灌注肺損傷的保護作用還體現(xiàn)在血流動力學和血氣指標的改善，動物存活率的提高。

進一步觀察各組肺組織的病理學變化，顯示與上述氧化應(yīng)激指標變化較為一致的變化，對照組可見較為嚴重的損害，亞細亞酸低劑量組肺組織損傷略有改善，而亞細亞酸中、高劑量組可見肺組織的明顯改善。Gao等[19]觀察亞細亞酸不同劑量(25、50、100 mg·kg-1)對成熟小鼠肝損傷均有保護作用，3種劑量均可抑制線粒體鈣內(nèi)流，阻止線粒體膜電位的下降，減輕線粒體腫脹。從本研究3種干預(yù)劑量來看，低劑量組氧化應(yīng)激和炎癥指標改善不明顯，而中和高劑量可明顯改善氧化應(yīng)激損傷，但亞細亞酸對缺血再灌注肺損傷的量效關(guān)系仍需進一步研究。

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Asiatic acid attenuates ischemia-reperfusion induced lung injury in infant rabbits

YANXian-gang,QIUWan-shan,JIABing

(Children′sHospitalofFudanUniversity,DepartmentofCardiovascularSurgery,Shanghai201102,China)

JIA Bin, E-mail:jiabing2012@hotmail.com

ObjectiveThe aim of the study was to examine whether asiatic acid could attenuate ischemia-reperfusion(I/R) induced lung injury in infant rabbits.Methods60 New Zealand white rabbits aged from 15 to 21 days were subjected to sham operation, I/R, low dose asiatic acid plus I/R, medium dose asiatic acid puls IR, and high dose asiatic acid puls I/R. I/R was induced by clamping the right pulmonary hilum for 1 hour and then removal of the clamp for 4 hours. Asiatic acid was given 3 days before operation by 7.5mg, 15, 30 mg·kg-1respectively. Production and expression of free radical species-hydroxyl radical (ROS-HR), malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-PX), myeloid differentiation factor-88(MyD-88), and muclear factors-κB(NF-κB) in the lung tissue were also evaluated. And temperature, hemodynamics, blood gases and neutrophil count were measured 2 hours after reperfusing. In addition, serum levels of interleukin-1β and tumor necrosis factor-α were measured during the ischemia-reperfusion process.ResultsThe infant lungs in asiatic acid middle and high dose groups had less neutrophil infiltration, edema, swelled alveolar epithelial and endothelial cells under light and electron microscopes. ②Compared wtih I/R group, asiatic acid reduced the production of ROS-HR and MDA and improved the activities of GSH-PX and SOD markedly, siginificantly decreased the serum levels of interleukin- 1β and tumor necrosis factor-α at 4 h time point after reperfusion, as well as the MyD88 and NF-κB of lung were siginificantly decreased(P<0.05).③Asiatic acid middle and high dose groups had good effect of attenuating I/R.ConclusionsAsiatic acid pretreatment reduced the lung damage induced by I/R in the infant rabbits

Infant rabbit; Ischemia-reperfusion; Lung injury; Asiatic acid

江蘇省自然科學基金：BK2009452

復(fù)旦大學附屬兒科醫(yī)院心血管中心 上海，201102

賈兵，E-mail:jiabing2012@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-5501.2013.02.014

2013-03-12

2013-04-01)

丁俊杰)