王 茜 ，張冬林 ，楊模華 ，邵俊培 ，李志輝 ，洪永輝

(1.林業(yè)生物技術(shù)湖南重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410004；2.中南林業(yè)科技大學(xué) 林學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410004；3. University of Georgia, USA GA 30602；4. 福建省漳平五一國(guó)有林場(chǎng)，福建漳平364400；5. 福建省龍巖市馬尾松研究中心，福建漳平 364400)

馬尾松優(yōu)良家系優(yōu)株ISSR遺傳距離分析

王 茜1,2，張冬林3，楊模華1,2，邵俊培1，李志輝1，洪永輝4,5

(1.林業(yè)生物技術(shù)湖南重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410004；2.中南林業(yè)科技大學(xué) 林學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410004；3. University of Georgia, USA GA 30602；4. 福建省漳平五一國(guó)有林場(chǎng)，福建漳平364400；5. 福建省龍巖市馬尾松研究中心，福建漳平 364400)

采用ΙSSR分子標(biāo)記對(duì)福建漳平五一林場(chǎng)28個(gè)馬尾松優(yōu)良家系最優(yōu)單株進(jìn)行遺傳分析，計(jì)算兩兩之間的遺傳距離，進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明：10條多態(tài)性引物共檢測(cè)到99個(gè)位點(diǎn)（從250～2 300 bp），其中93個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)百分率(P)為93.94%；28個(gè)馬尾松無(wú)性系兩兩之間的分子遺傳距離在0.212 1 ～0.565 6之間，遺傳距離大于0.5的無(wú)性系對(duì)有11組，遺傳距離小于0.25的無(wú)性系對(duì)有6組；在聚類分析自檢舉值為48處，可將28份馬尾松無(wú)性系分為9類，其中7個(gè)無(wú)性系單獨(dú)聚類，其他21個(gè)無(wú)性系聚成2類；遺傳距離較大的無(wú)性系組分別出現(xiàn)在不同的聚類中，表明這些無(wú)性系組兩兩之間具有相對(duì)較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。本研究為馬尾松高世代育種群體的選育提供分子水平上的依據(jù)，為分子標(biāo)記指導(dǎo)馬尾松育種奠定了一定的研究基礎(chǔ)。

馬尾松；ΙSSR；遺傳距離；雜種優(yōu)勢(shì)

馬尾松Pinus massoniana Lamb 為松科松屬常綠高大喬木，是我國(guó)南方松屬中分布范圍最廣、人工造林面積最大的重要用材樹(shù)種，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，可供工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的建筑、枕木、礦柱、制板、包裝箱、膠合板、制漿造紙等使用。馬尾松的遺傳改良已經(jīng)進(jìn)入高世代種子園營(yíng)建階段[1]。由種子園選育，經(jīng)子代測(cè)定而選出的優(yōu)良個(gè)體，用于高世代種子園營(yíng)建過(guò)程中，有必要了解育種群體種質(zhì)個(gè)體之間的遺傳背景和親緣關(guān)系，這樣在選擇家系最優(yōu)株作為高世代育種群體組成時(shí)，還需要考慮雜交親本間盡可能具有較高雜種優(yōu)勢(shì)的可能，才能獲得理想的種子園育種遺傳增益。當(dāng)前，在遺傳和生理生化水平上，對(duì)親本間潛在雜種優(yōu)勢(shì)進(jìn)行預(yù)測(cè)的方法主要有配合力法[2]、遺傳距離法[3-4]、葉綠體互補(bǔ)法[5]、同工酶法[6]、DNA 分子標(biāo)記差異法[7]等?；赑CR的分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于林木遺傳育種[8]等領(lǐng)域， DNA分子標(biāo)記遺傳距離法已被應(yīng)用于植物雜種優(yōu)勢(shì)的預(yù)測(cè)中。如黃光文等[9]利用ΙSSR分子標(biāo)記對(duì)水稻9個(gè)品種的遺傳距離與其不完全雙列雜交F1代個(gè)體的生物量、穎花等性狀進(jìn)行相關(guān)性研究，結(jié)果表明，遺傳距離與生物學(xué)產(chǎn)量的中親優(yōu)勢(shì)具有極顯著的正相關(guān)，穎花和株高的中親優(yōu)勢(shì)相關(guān)性也很顯著。張一等[10]對(duì)馬尾松雙列雜交親本遺傳距離與雜種生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果表明，隨著親本間遺傳距離的增大，子代生長(zhǎng)性狀的雜種優(yōu)勢(shì)呈線性增加，因此，應(yīng)用遺傳距離分析手段進(jìn)行雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)具有一定的科學(xué)性。

試驗(yàn)對(duì)福建漳平五一林場(chǎng)的28個(gè)馬尾松家系優(yōu)選單株進(jìn)行ΙSSR分子標(biāo)記分析，計(jì)算兩兩優(yōu)株之間的遺傳距離，并通過(guò)PAUP4.0，PopGene32和NTSYS-PC軟件對(duì)其進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳聚類分析，預(yù)測(cè)具有較高雜種優(yōu)勢(shì)，能用于高世代育種群體構(gòu)建的優(yōu)株親本組合，為福建漳平五一林場(chǎng)馬尾松高世代育種群體的選育提供分子水平的選擇依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

實(shí)驗(yàn)材料采自福建漳平五一林場(chǎng)馬尾松家系實(shí)驗(yàn)林，28個(gè)優(yōu)良單株為洪永輝等[11]報(bào)道的經(jīng)過(guò)子代測(cè)定，綜合分析后優(yōu)選出來(lái)的優(yōu)良家系最優(yōu)單株。2011年3月底采集幼嫩針葉，硅膠干燥帶回實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)溆茫?8個(gè)優(yōu)良的單株（無(wú)性系源株）產(chǎn)地來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 28個(gè)馬尾松家系優(yōu)株樣品來(lái)源Table 1 The 28 elite clones of masson pine (Pinus massoniana Lamb.)

1.2 總 DNA 的提取

采用改良的CTAB法提取基因組總DNA，經(jīng)0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)Marker條帶與DNA條帶亮度的比對(duì)，確定不同樣本的DNA濃度，最后稀釋至15ng/μL左右保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ΙSSR-PCR 擴(kuò)增

擴(kuò)增反應(yīng)在美國(guó)ABΙ公司的9700型PCR儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)總體積為20 μL，其中包括1.5 μL 的 2.5 mmol/L dNTPs，0.75 μL 的 50 mmol/L的 MgCl2，2.0 μL 的 10×PCR buffer，0.6 μL 的primer，0.2 μL 5 U/μL 的 Taq DNA ploymerase，1μL 的 15 ng/μL 的 DNA 模板，經(jīng)優(yōu)化的 PCR 擴(kuò)增程序是：94℃預(yù)變性5 min；38個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán) 94℃變性 30 s，56 ℃變性 45 s，72 ℃延伸 2 min；72℃延伸7 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.4%的瓊脂糖凝膠（含0.1 mg/mL溴化乙錠）中電泳1.5 h，電泳液為0.5×TBE，將電泳分離的條帶在Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)中拍照保存。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

在Quantity One凝膠成像分析軟件的幫助下，對(duì)分析樣品的擴(kuò)增條帶進(jìn)行記錄，有擴(kuò)增條帶賦值為“1”，無(wú)擴(kuò)增條帶賦值為“0”，形成“0/1”數(shù)據(jù)矩陣圖。利用PAUP4.0、PopGene32和NTSYS－PC三種群體遺傳結(jié)構(gòu)分析軟件對(duì)28個(gè)馬尾松優(yōu)株無(wú)性系的ΙSSR數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選及 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)先用3個(gè)馬尾松DNA樣品為模板，對(duì)100條ΙSSR引物（哥倫比亞大學(xué)提供的序列）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從中篩選出穩(wěn)定性強(qiáng)，重復(fù)性好，多態(tài)性豐富的引物10條（見(jiàn)表2），用于28個(gè)馬尾松樣品的PCR擴(kuò)增，圖1為ΙSSR引物836在部分樣本中擴(kuò)增后的電泳圖。10條ΙSSR多態(tài)性引物在所有無(wú)性系中共檢測(cè)到99個(gè)位點(diǎn)，位點(diǎn)大小位于 250 bp～ 2 300 bp之間，其中有 93個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)百分率（P)為93.94%，每條引物的擴(kuò)增條帶頻率平均值位于0.43～0.71之間（表2）。不同的引物在28個(gè)樣品中所檢測(cè)到的位點(diǎn)數(shù)在7～14之間，引物826檢測(cè)到的位點(diǎn)最多（14），引物834檢測(cè)到的位點(diǎn)數(shù)最少（7），每條引物平均檢測(cè)到9.3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。在所有的93個(gè)多態(tài)位點(diǎn)中，有4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的出現(xiàn)頻率小于0.16，79個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的出現(xiàn)頻率大于0.16小于0.86，另有10個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的出現(xiàn)頻率大于0.86（圖2）。

表2 篩選出的引物序列及其多態(tài)性Table 2 Sequences and polymorphism of ISSR primer

圖1 引物836在馬尾松部分樣本中的ΙSSR電泳圖Fig.1 Electrophoretic analysis of masson pine samples by primer 836

圖2 93 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的頻率分布Fig.2 Frequency distributions of 93 polymorphic alleles

2.2 遺傳距離分析

利用PAUP4.0遺傳分析軟件對(duì)28個(gè)馬尾松優(yōu)株無(wú)性系DNA的ΙSSR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行遺傳距離分析，得到兩兩之間的遺傳距離。樣品間的遺傳距離在一定程度上能說(shuō)明它們親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。從遺傳距離表中發(fā)現(xiàn)，28個(gè)無(wú)性系兩兩之間的遺傳距離在0.2121～0.5656之間，遺傳距離最大的是181和195，兩無(wú)性系之間遺傳距離最小的是568和657；在所有的兩兩比較中，遺傳距離大于0.5的分別為：181與（195、34、127、666），519與（346、34），603與（666、392、655、6），392與194這11組無(wú)性系對(duì)。遺傳距離小于0.25的分別為：195與386，568與657，347與34，347與567，392與6，127與592這6對(duì)。

2.3 聚類分析

利用PAUP4.0對(duì)28個(gè)馬尾松家系優(yōu)株樣本進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)聚類分析，采用鄰接聚類法（NJ）得到聚類圖（見(jiàn)圖3）。由圖3看出,在自檢舉值48的虛線處，有7個(gè)無(wú)性系如519、728、486、386、615、655、181分別各自單獨(dú)聚類，說(shuō)明這7個(gè)無(wú)性系各自與其它無(wú)性系之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，另外的21個(gè)無(wú)性系則分別聚為2大類，其中無(wú)性系332、603、30、85這四個(gè)無(wú)性系逐級(jí)聚類，說(shuō)明它們之間的親緣關(guān)系很近，同樣，194、62、592這三個(gè)無(wú)性系，6、392、127這三個(gè)無(wú)性系，也逐級(jí)聚類，表明它們的親緣關(guān)系也非常近。對(duì)于這些親緣關(guān)系表現(xiàn)特別近的無(wú)性系組，在今后的雜交育種中，建設(shè)不宜進(jìn)行組內(nèi)雜交親本選擇，而應(yīng)盡量選擇位于不同分類群中的無(wú)性系作為親本，以利用子代雜種優(yōu)勢(shì)獲得較高的遺傳增益。

圖3 28 個(gè)馬尾松家系優(yōu)株 PAUP 4.0 鄰接（NJ）聚類圖Fig. 3 Dendrogram among 28 elite clones of Pinus massoniana Lamb based on the genetic distances generated by PAUP 4.0

從產(chǎn)地種源來(lái)看，28個(gè)優(yōu)良家系優(yōu)株樣品中，有17個(gè)來(lái)自五一林場(chǎng)馬尾松種子園， 11個(gè)來(lái)自西陂林場(chǎng)馬尾松種子園，而在28個(gè)優(yōu)株無(wú)性系的聚類圖上，兩個(gè)種子園的樣品并沒(méi)有分別聚類，而是相互混合分散在各個(gè)聚類群中。這與兩個(gè)種子園在建園時(shí)，部分親本采用了同一無(wú)性系嫁接，因而部分親本基因型相同，這導(dǎo)致了來(lái)自不同種子園的家系子代，其親緣關(guān)系也還比較近，因此，當(dāng)從表型方面選擇高世代育種材料時(shí)，既要考慮家系子代來(lái)源，也還要考慮它們之間實(shí)際的親緣關(guān)系，避免因近親繁殖而降低高世代種子園親本材料的遺傳多樣性水平。

2.4 遺傳多樣性分析

利用POPGENE32群體分析軟件對(duì)五一和西陂兩個(gè)種子園區(qū)的28個(gè)無(wú)性系進(jìn)行群體遺傳多樣性分析（見(jiàn)表4），結(jié)果表明：五一林場(chǎng)種子園的總多態(tài)位點(diǎn)數(shù)為96，總多態(tài)位點(diǎn)百分比為96.97%，總 Shannon 信息指數(shù) (I)為 0.564 3，總Nei’s基因多樣性（h）為 0.386 3，與張冬林等[11]對(duì)湖南城步種子園遺傳多樣性的研究結(jié)果相比略高（Shannon信息指數(shù)和Nei’s基因多樣性分別為0.503 0，0.334 7）。表明本馬尾松家系優(yōu)株群體具有較高的遺傳多樣性水平。其總?cè)后w基因多樣性（Ht）為0.3860，群體內(nèi)基因多樣性（Hs）為0.374 8，群體間基因分化系數(shù)為0.028 9，來(lái)自兩個(gè)種子園家系優(yōu)株群體間的遺傳變異約為2.89%，而存在于種子園家系優(yōu)株群體內(nèi)的變異量高達(dá)97.11%，這與李志輝等[12-13]對(duì)馬尾松群體遺傳多樣性結(jié)構(gòu)分析的研究結(jié)果一致，即馬尾松群體內(nèi)存在著非常豐富的遺傳變異，基因多樣性水平高，群體間遺傳分化較小。張薇等[14]對(duì)福建馬尾松實(shí)生種子園自由授粉子代群體的研究結(jié)果表明，自由授粉子代群體的Shannon多樣性指數(shù)為1.034，Nei多樣度為0.574 0，這些多樣性測(cè)度指標(biāo)明顯高于本研究中相關(guān)指標(biāo)的賦值水平。我們對(duì)采樣策略進(jìn)行的比較，發(fā)現(xiàn)，張薇等所取樣的實(shí)驗(yàn)材料為馬尾松完全自由授粉子代實(shí)生苗群體[14]，而我們?nèi)拥膶?shí)驗(yàn)材料為經(jīng)12年子代測(cè)定試驗(yàn)后獲得的優(yōu)良家系最優(yōu)單株[11]，采樣策略不同，對(duì)種子園子代群體的選擇強(qiáng)度不一樣。因此，在高強(qiáng)度選擇取樣策略下，本論文中的Shannon多樣性指數(shù)以及Nei’s基因多樣性水平值與張薇等[13]研究結(jié)果比較，明顯的偏低。這樣的研究結(jié)果也為育種世代與育種群體的遺傳多樣性水平的負(fù)相關(guān)關(guān)系進(jìn)一步提供了佐證，符合群體遺傳多樣性水平發(fā)展的一般規(guī)律，即隨著種子園育種世代的提高，其選擇強(qiáng)度增加，與此同時(shí)育種群體的遺傳多樣性水平確會(huì)有一定程度的下降。

表3 馬尾松群體遺傳多樣性分析Table 3 Genetic analysis of Pinus massoniana Lamb.

2.5 馬尾松家系優(yōu)株間 NTSYS-PCA 主成分分析

利用NTSYS-PC軟件對(duì)28個(gè)馬尾松家系優(yōu)株進(jìn)行主成分分析，計(jì)算Jaccard系數(shù)相似性矩陣，進(jìn)行PCA主成分分析（見(jiàn)圖4）。28個(gè)無(wú)性系聚類結(jié)果與PAUP 4.0結(jié)果相似。在PCA聚類圖示的密集和分散度的模式中，對(duì)于密集區(qū)域的樣本，其遺傳一致度高，在種質(zhì)篩選時(shí)應(yīng)綜合考慮，選擇其一便可；而對(duì)那些分散分布的無(wú)性系，說(shuō)明其種質(zhì)特異性較高，可作為高世代親本選擇時(shí)的重點(diǎn)選擇對(duì)象。由此，我們可對(duì)分布密集區(qū)的樣本進(jìn)行篩選，而對(duì)分散區(qū)的樣本予以保留，特別是那些處于外圍的樣本，如34、592、519、603和181這五個(gè)無(wú)性系可作為重點(diǎn)選擇對(duì)象。

3 結(jié)論與討論

圖4 28 個(gè)家系優(yōu)株的 NTSYS-PC 主成分分析Fig.4 Principal component analysis by NTSYS-PC software for 28 clones

親本遺傳距離與雜交優(yōu)勢(shì)的相關(guān)性研究為選擇育種提供了一定的理論依據(jù)[15]。對(duì)馬尾松雙列雜交親本遺傳距離與雜種生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的相關(guān)性分析結(jié)果表明，隨著親本間遺傳距離的增大，子代生長(zhǎng)性狀的雜種優(yōu)勢(shì)呈線性增加[10]，因此，在選擇雜交育種親本時(shí)，一方面考慮表型優(yōu)株，同時(shí)也考慮選擇遺傳距離較大的親本對(duì)，可在一定程度上提高子代雜種優(yōu)勢(shì)水平，從而獲得胸徑、材積等表型性狀優(yōu)良的子代，以獲得更高的種子園育種遺傳增益。

本試驗(yàn)對(duì)馬尾松28個(gè)家系優(yōu)株進(jìn)行遺傳距離聚類及遺傳關(guān)系分析，并以此可作為高世代雜交育種親本選擇時(shí)的部分依據(jù)，結(jié)果表明：

1）根據(jù)PAUP4.0聚類分析結(jié)果，作為育種群體的親本，應(yīng)盡量選擇遺傳距離大于0.5的組合：181和（195、34、127、666），519和（346、34），603和（666、392、655、6），392和 194這11對(duì)無(wú)性系；而應(yīng)盡量避免遺傳距離小于0.25的無(wú)性系對(duì)。根據(jù)NTSYS-PC軟件分析結(jié)果，可重點(diǎn)選擇34、592、519、603和181這五個(gè)無(wú)性系作為育種親本進(jìn)行雜交育種，子代獲取較高雜種優(yōu)勢(shì)的可能性更大，并能產(chǎn)生較高的種子園育種遺傳增益。

2）對(duì)這28個(gè)最優(yōu)家系的最優(yōu)單株進(jìn)行PAUP 4.0聚類分析表明：在自檢舉值為48處，7個(gè)無(wú)性系樣品單獨(dú)各自聚類，而其他21個(gè)無(wú)性系樣品分別聚為2類。除了無(wú)性系368與194外，其余10組遺傳距離大于0.5的無(wú)性系對(duì)，成對(duì)兩個(gè)無(wú)性系均分別出現(xiàn)在不同的聚類群中。這說(shuō)明，采用分子標(biāo)記對(duì)育種群體進(jìn)行分子遺傳結(jié)構(gòu)分析，能一定程度地闡明育種群體的遺傳背景，揭示其親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，從而可為指導(dǎo)馬尾松高世代種子園營(yíng)建提供分子水平的理論依據(jù)。

3）從各家系優(yōu)株無(wú)性系的產(chǎn)地來(lái)源來(lái)看，盡管地理距離在一定程度上決定了群體間的遺傳距離及遺傳多樣性水平，但隨著種子園育種改良世代的增加，這種地理距離的決定關(guān)系會(huì)因種子園世代的提高而減弱；尤其是隨著選擇強(qiáng)度的增加，育種群體的遺傳多樣性水平會(huì)有一定程度的下降。因此，為有預(yù)見(jiàn)性地拓寬高世代種子園育種親本的遺傳多樣性水平，應(yīng)適當(dāng)增加上一世代育種繁育系統(tǒng)之外的優(yōu)良親本，并可借助分子標(biāo)記技術(shù)手段對(duì)進(jìn)入高世代育種群體的樣本進(jìn)行遺傳多樣性水平和親緣關(guān)系檢測(cè)，以提高雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)水平。

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ISSR analysis of genetic distance of Pinus massoniana Lamb. Elite clones

WANG Qian1,2, ZHANG Dong-lin3, YANG Mo-hua1,2, SHAO Jun-pei1, LΙ Zhi-hui1, HONG Yong-hui4,5
(1.Hunan Provincial Key Laboratory of Forestry Biotechnology, Changsha 410004, Hunan, China; 2.College of Forestry, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China; 3. University of Georgia, USA GA 30602; 4.Wuyi National Forest Farm Fujian Province, Zhangping 364400, Fujian, China; 5. Mason Pine Research Center of Longyan Fujian Province, Zhangping 364400, Fujian, China)

ΙSSR (Ιntro-simple Sequence Repeat) were employed to study the genetic analysis and GD ( genetic distance) among 28 elite clones in Pinus massoniana Lamb. The results indicated that 10 polymorphism markers totally produced 99 alleles (size ranged from 250 to 2300bp) and 93 were polymorphic, the percentage of polymorphic alleles (P) was 93.94%. The GD among 28 clones ranged from 0.2121 to 0.5656. There were 11 pairs of clones’ GD larger than 0.5 and 6 pairs of clones’ GD less than 0.25; The 28 clones were clustered into nine groups at the value of 48, of which seven clones were clustered separately and the other 21 clones were clustered into two groups; Those pairs of clones with larger GD appeared in different groups which showed a distant relationship with each other. These f i ndings provided some insight into the selection of elite clones in breeding population on advanced generation orchard and it would guide the breeding work of Pinus massoniana Lamb more eff i ciently at the molecular level.

Pinus massoniana Lamb; ΙSSR marker; genetic distance; hybrid vigour

S791.248

A

1673-923X(2013)12-0072-05

2013-04-01

湖南省教育廳優(yōu)秀青年基金項(xiàng)目資助（09B112）

王 茜（1988-），女，山西運(yùn)城人，碩士研究生，從事林木定向育種理論與技術(shù)研究

楊模華（1974-），博士，副教授，主要從事森林培育教學(xué)和科研；E-mail：ymh163@163.com

[本文編校：吳 彬 ]