趙艷紅，王琳，張鐵佳，張文廣，張燕軍，蘇蕊，劉志紅，王瑞軍，李金泉

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，呼和浩特 010018）

MTNR1a基因在內(nèi)蒙古絨山羊下丘腦、垂體及卵巢中的表達

趙艷紅1,2，王琳1,2，張鐵佳1,2，張文廣1,2，張燕軍1,2，蘇蕊1,2，劉志紅1,2，王瑞軍1,2，李金泉1,2

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，呼和浩特 010018）

采用RT-PCR和原位雜交方法檢測MTNR1a mRNA在內(nèi)蒙古絨山羊下丘腦、垂體及卵巢中的表達及分布。結果表明，MTNR1a基因在內(nèi)蒙古絨山羊下丘腦、垂體、卵巢中均有表達，且在下丘腦、垂體組織中呈廣泛表達，在卵巢的卵泡膜細胞陽性表達。下丘腦、垂體、卵巢是褪黑激素作用靶器官，闡明褪黑激素對內(nèi)蒙古絨山羊繁殖力的影響是通過與靶器官受體基因結合發(fā)揮其功能，為進一步探討褪黑激素對內(nèi)蒙古絨山羊繁殖影響的作用途徑及調控機理奠定基礎。

MTNR1a；絨山羊；下丘腦；垂體；卵巢；表達；RT-PCR；原位雜交

內(nèi)蒙古絨山羊屬于季節(jié)性繁殖動物，其發(fā)情周期受光照時間影響，一般在光照由長變短的秋季發(fā)情，由于光照時間變短促使機體分泌多種激素參與調節(jié)繁殖，其中下丘腦-垂體-性腺軸對機體內(nèi)激素的調控起重要作用[1]。調節(jié)哺乳動物生殖的神經(jīng)中樞是下丘腦的正中隆起和視交叉[2]。通過大腦皮層的神經(jīng)遞質將動物體內(nèi)的激素和外部的刺激，傳遞到下丘腦，并產(chǎn)生促性腺激素釋放激素。促性腺激素釋放激素一方面作用于垂體，使其產(chǎn)生LH、FSH及黃體生成，LH促進雌性排卵而FSH刺激卵泡發(fā)育，另一方面促性腺激素釋放激素也可直接與卵巢作用[3]，使卵巢分泌的類固醇激素對下丘腦或垂體起負反饋作用。研究表明，下丘腦中存在雌激素受體，雌激素與受體結合進而影響下丘腦神經(jīng)元結構和功能[4]。使促性腺激素釋放激素釋放呈波動式[5]。因此，下丘腦、垂體、卵巢之間是相互制約、相互影響、共同調控動物繁殖性能的統(tǒng)一體。

褪黑激素（Melatonin，MEL）是吲哚類激素[6]，在人和哺乳動物體內(nèi)主要由腦部松果腺分泌，其分泌受光照影響，表現(xiàn)出明顯的晝低夜高的節(jié)律變化。動物褪黑素的分泌還能根據(jù)年光照周期變化而變化，調整內(nèi)分泌系統(tǒng)等以適應環(huán)境變化。作為神經(jīng)內(nèi)分泌傳感器的松果腺，能接受來自視網(wǎng)膜和視交叉上核的光照信息，通過調節(jié)褪黑激素的分泌將這一信息傳遞給靶組織和靶細胞。光照控制褪黑激素分泌，呈晝少夜多、長日照少、短日照多分泌規(guī)律[7]。研究表明，季節(jié)性繁殖動物的生殖行為隨褪黑激素分泌周期變化而變化，褪黑激素是哺乳動物繁殖節(jié)律系統(tǒng)重要因子[8]。光通過視網(wǎng)膜作用于松果體，使之分泌褪黑激素，褪黑激素通過下丘腦-垂體-性腺軸影響動物繁殖系統(tǒng)功能。

研究表明，褪黑激素主要作用于下丘腦MBH區(qū)，在下丘腦水平上調節(jié)促性腺激素分泌，影響生殖系統(tǒng)功能，完成其對動物繁殖的光周期調節(jié)作用，也可直接作用于垂體腺結節(jié)部（Parstuberalis，PT）介導光周期信號[9]。垂體中存在大量的褪黑激素受體（MR），褪黑激素與受體結合抑制垂體對下丘腦分泌GnRH反應，使垂體FSH和LH分泌量減少，使性腺軸處于發(fā)育遲緩狀態(tài)，隨年齡增長，垂體中褪黑激素受體（MR）數(shù)量減少，缺少與褪黑激素結合受體，對垂體抑制作用減弱甚至消失，從而對生殖軸的抑制作用隨之消失。褪黑激素也可與卵巢、睪丸[10]和腎上腺細胞中褪黑激素受體結合直接影響性腺激素分泌和合成，控制生殖器官發(fā)育和成熟。通過對蟾蜍的線粒體分離培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)褪黑激素可刺激枸緣酸氧化，提高C/F值，而蟾蜍C/F值是反應性機能特征值，一般秋季最高，抑制排卵[11]。

本研究以內(nèi)蒙古絨山羊為研究對象，采取成年母羊卵巢、下丘腦、垂體組織，采用ISH和RTPCR技術檢測褪黑激素受體1a基因（Melatonin receptor 1a，MTNR1a）在以上三個組織中核酸水平表達及分布，闡明褪黑激素對季節(jié)性繁殖動物變化影響，以期通過人為手段調節(jié)絨山羊的季節(jié)發(fā)情，提高山羊繁殖能力。

1 材料與方法

1.1 材料

所有樣品均采自內(nèi)蒙古鄂爾多斯市鄂托克旗阿爾巴斯種羊場成年母山羊，將獲得的下丘腦、垂體及卵巢組織一部分用4%多聚甲醛固定，用于制作原位雜交用的石蠟切塊，另一部分于-80℃冷凍保存，用于RNA提取。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取、純化及反轉錄

按照Promega公司提供的試劑盒說明書進行總RNA提取、純化及反轉錄，最后將獲得的cDNA分裝，并于-20℃保存。

1.2.2 引物設計

根據(jù)GenBank中公布的綿羊、牛、人、鼠和黑猩猩等動物的MTNR1a基因的mRNA序列，進行序列比對找到保守序列，利用Premier 5.0設計軟件和引物設計原則進行設計，其中上游引物5'CTGTCC GTGTATCGGAACAAG 3'，下游引物5'CCTGGGG CTTTAGTTTCGGTTTGT 3'，擴增片段大小為550 bp，引物為跨內(nèi)含子。在獲得的550 bp的MNTR1acDNA上再設計一對引物，上游引物5'AACTACGA GCATCGGAACT 3'，下游引物5'CTTGGCACTGGC GTCTAT 3'，預計目的片段為364 bp，將獲得的產(chǎn)物進行克隆、標記，作為制備MNTR1a探針模板，引物序列均由大連寶生物公司合成。

1.2.3 RT-PCR擴增

RT-PCR擴增反應總體積25 μL：模板cDNA約（50 ng·L-1）1.0 μL、上下游引物（10 pmol·L-1）各1.0 μL、Mix 12 μL、三蒸水10 μL。

RT-PCR反應程序：95℃預變性5 min；94℃變性30 s，退火溫度分別為59和56℃，30 s，72℃延伸30 s，經(jīng)過33個循環(huán)后；于72℃延伸10 min。RT-PCR擴增產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 mRNA結果檢測

取總mRNA 4 μL，電壓80 V，時間25 min，用1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，紫外燈觀察并拍照保存。

1.2.5 RT-PCR擴增產(chǎn)物檢測

取PCR產(chǎn)物5 μL，100 V電壓，25 min，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以DL2000 Marker作分子質量對照，在紫外燈下將明亮單一的條帶切膠回收，并進行測序，其余于4℃保存。

1.2.6 組織原位雜交（ISH）

1.2.6.1 組織切片的制備

將下丘腦、垂體及卵巢組織放在4%多聚甲醛中，4℃過夜固定；次日，用1×PBS緩沖液沖洗固定好的組織樣4次，每次1.5 h，之后，于4℃過夜；次日，分別用95%、90%、75%酒精脫水、透明，最后浸蠟、包埋；連續(xù)切8 μm厚的切片，載玻片用多聚賴氨酸處理，然后將切片貼于載玻片上，在40℃烘箱中烘烤24 h。

1.2.6.2 探針制備

將獲得的片段為364 bp的MNTR1acDNA擴增產(chǎn)物，凝膠回收并純化；將純化產(chǎn)物與PGM-T載體連接，并用DH5α感受態(tài)細胞轉化，選取白斑單菌落，進行過夜培養(yǎng)；經(jīng)過凝膠電泳鑒定后提取質粒DNA，并以質粒DNA為模板，用通用引物SP6、T7進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物分別作為反義鏈、正義鏈探針的模板。選用Roche公司生產(chǎn)的DIG試劑盒進行探針標記，制備好的探針保存于-80℃冰箱中。

1.2.6.3 原位雜交

將貼于載玻片上的已烘烤好的下丘腦、垂體、卵巢組織切片于無酶水中展片，繼續(xù)42℃烘烤24 h。然后經(jīng)過預雜交、雜交、顯色、封片，最后于37℃烘干，并拍照分析。

2 結果與分析

2.1 RNA提取結果

取4 μL總RNA，電壓80 V，時間25 min， 1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見28S RNA和18S RNA兩條帶較清晰明亮、無拖尾痕跡（見圖1），說明提取的RNA完整、無降解。

圖1 下丘腦、垂體及卵巢總RNA提取結果Fig.1 RNA extract of the hypothalamus, pituitary and ovary

2.2 總RNA的純化結果

經(jīng)紫外分光光度檢測，所提取的總RNA OD260/280比值均在1.9和2.0之間，說明RNA純度較高，可以進行后續(xù)試驗。

2.3 RT-PCR擴增結果

利用設計的兩對引物分別在下丘腦、垂體及卵巢組織中擴增出550和364 bp清晰明亮的MTNR1acDNA特異片段，與預計片段大小一致，經(jīng)過克隆、測序證實為內(nèi)蒙古絨山羊MTNR1acDNA序列。將兩段擴增序列進行瓊脂糖電泳檢測，得到結果如圖2、3所示。

圖2 MTNR1a RT-PCR擴增結果Fig.2 RT-PCR amplification results of MTNR1a

圖3 MTNR1a cDNA PCR擴增結果Fig.3 PCR amplification results of MTNR1a

2.4 原位雜交結果

2.4.1MTNR1a在下丘腦、垂體及卵巢組織中表達分布

用下丘腦組織擴增出的364 bp序列作為MTNR1a基因的cDNA探針，分別在卵巢、下丘腦、垂體組織切片上進行ISH檢測，在下丘腦和垂體組織中檢測到呈廣泛表達的較強陽性信號（見圖4A、B），在卵巢的卵泡膜細胞和顆粒細胞中檢測到較強的陽性信號（見圖4C）。

圖4 內(nèi)蒙古絨山羊MNTR1a在下丘腦、垂體、卵巢原位雜交結果Fig.4 In situ hybridization results of Inner Mongolia cashmere goat MNTR1a in the hypothalamus,pituitary and ovary

3 討論與結論

有關褪黑激素分泌與季節(jié)性繁殖的聯(lián)系可能存在于下丘腦-垂體-性腺軸上。研究發(fā)現(xiàn)，MTNR1a基因在不同種屬的不同組織均有廣泛表達，在表達分布上不同種屬間存在特異性[12-13]，Poblos等提出褪黑激素受體在所有細胞中均存在表達[14]。MTNR1a受體基因在老鼠大腦動脈、松果體、視丘下部都存在表達。存在于下丘腦中的MTNR1a在褪黑激素調節(jié)晝夜節(jié)律功能中發(fā)揮重要作用[15]，而在垂體MTNR1a則是與生殖反應有關[16]。Yu等認為褪黑激素可能作用于多個位點[17]，將不同位點作用累積，多動物生殖腺系統(tǒng)起調節(jié)作用。在下丘腦的多個部位中也存在MTNR1a表達，到目前為止，下丘腦參與調節(jié)活動的部位仍不明確[18]。何蘭花研究表明[19]，光照對生殖機能的調節(jié)通過褪黑激素介導傳遞到下丘腦一垂體一性腺軸，褪黑激素對長日照季節(jié)性繁殖動物的生殖系統(tǒng)有抑制作用，在下丘腦水平上調節(jié)促性腺激素分泌，影響生殖系統(tǒng)功能，還能直接調節(jié)性腺激素如LH和FSH等激素的合成和分泌。Tamura等研究發(fā)現(xiàn)褪黑激素直接影響卵巢功能是通過卵巢顆粒細胞中的受體來實現(xiàn)[20]。

褪黑激素調節(jié)綿羊的繁殖功能是通過視丘下部乳頭前體實現(xiàn)，Migaud等利用ISH和RT-PCR技術在綿羊的視丘下部乳頭前體檢測到MTNR1受體基因的cDNA表達[21]，通過35S標記羊的MTNR1a肋骨探針I(yè)SH方法，證實MTNR1amRNA在視丘下部乳頭前體表達。MTNR1受體基因在許多綿羊品種中存在多態(tài)，體現(xiàn)褪黑激素影響季節(jié)性繁殖效應。結果顯示MTNR1amRNA在綿羊視丘下部乳頭前體表達，且存在晝夜節(jié)律差異。

本研究采用RT-PCR技術，在內(nèi)蒙古絨山羊下丘腦、垂體及卵巢中檢測到MTNR1a基因表達。通過ISH技術檢測到MTNR1a基因在下丘腦、垂體中廣泛表達，在卵巢的卵泡膜細胞和顆粒細胞均有表達。因此，認為下丘腦、垂體和卵巢可能是褪黑激素作用的靶器官，褪黑激素與這些組織中MTNR1a受體結合，對季節(jié)性繁殖哺乳動物的繁殖產(chǎn)生影響。

[1]王建辰.家畜生殖內(nèi)分泌[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1993:32-102.

[2]謝啟文.神經(jīng)內(nèi)分泌學[M].沈陽:遼寧科學技術出版社,1990.

[3]袁其曉.排卵[J].國外醫(yī)學-計劃生育、婦產(chǎn)科學分冊,1980(4): 144.

[4]Dufourny L,Warembourg M.Estrogen modulation of neu-ropeptides:somatostatin,neurotensin and substance P,in theventrolateral and arcuate nuclei of the female guinea pig[J].Neurosci Res,1999,33(3):233-238.

[5]Tilbrook A J,De Kretser D M,Cummins J T,et al.Thenegative feedback effects of testicular steroids are predom-inantly at the hypothalamus in the ram[J].Endocrinology,1991,129(6):3080-3092.

[6]Cutando A,Gómez-Moreno G,Arana C,et al.Melatonin stimulates osteointegration of dental implants[J].J Pineal Res,2008,45 (2):174-179.

[7]王林楓.光照和埋植褪黑激素對內(nèi)蒙古白絨山羊含氮物質分配和產(chǎn)絨性能的影響及調控的研究[D].呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學,2005:31-32.

[8]Carter D S,Goldman B D.Progonadal role of the pineal in the Djungarian hamster(Phodopus sungorus sungorus):Media-tion by melatonin[J].Endocrinology,1983,113(4):1268-1273.

[9]von Gall C,Stehle J H,Weaver D R.Mammalian melatonin receptors:Molecular biology and signal transduction[J].Cell Tissue Res,2002,309(1):151-162.

[10]宋興超,薛海龍,魏海軍,等.外源褪黑激素對水貂睪丸形態(tài)及組織學結構的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2012,43(9):107-112.

[11]Atenoer M,Romero J R,Brauckmann E,et al.Effects of the pineal gland and MT on the metabolism of oocytes in vitro on ovulation in Bufo arenarum[J].J Exp Zool,1994,268:436.

[12]Williams L M,Hannah L T,Hastings M H,et al.Melatonin receptors in the rat brain and pituitary[J].J Pineal Res,1995,19 (4):173-177.

[13]Shin S Y W,Ng N,Pang S F.A molecular perspective of the genetic relationship of G-protein coupled melatonin receptor subtypes[J].J Pineal Res,1996,20(4):198-204.

[14]Pablos M I,Guerrero J M,Oritz G G,et al.Both melatonin and a putative nuclear melatonin receptor agonist CGP 52608 stimulate glutathione peroxidase and glutathione reductase activities in mouse brain in vivo[J].Neuroendocrinol Lett,1997,18(2):49-58.

[15]Weaver D R,Stehle J H,Stopa E G,et al.Melatonin receptors in human hypothalamus and pituitary:Implications for circadian and reproductive responses to melatonin[J].J Clin Endocrinol Metab, 1993,76(2):295-301.

[16]Ross W A,Morgan P J.The pars tuberalis as a target of the central clock[J].Cell Tissue Res,2002,309(1):163-171.

[17]Yu Z H,Chow P H,Pang S F.Identification and characterization of I[125-I]-iodomelatonin binding sites in the rat epididymis[J].J Pineal Res,1994,17(4):195-201.

[18]Shiu S Y W,Yu Z H,Chow P H,et al.Putative melatonin receptors in the male reproductive tissues[J].Front Horm Res, 1996,21:90-100.

[19]何蘭花.褪黑激素的研究進展[J].動物科學與動物醫(yī)學,2002,19 (10):10-12.

[20]Tamura H,Nakamura Y,Korkmaz A,et al.Melatonin and the ova-ry:Physiological and pathophysiological implications[J].Fertil Steril,2009,92(1):328-343.

[21]Migaud M,Daveau A,Malpaux B.MTNR1A melatonin receptors in the ovine premammillary hypothalamus:day-night variation in the expressionofthetranscripts[J].BiolReprod,2005,72(2):393-398.

Expression ofMTNR1agene in hypothalamus,pituitary and ovary of Inner Mongolian cashmere goats

ZHAO Yanhong1,2,WANG Lin1,2,ZHANG Tiejia1,2, ZHANG Wenguang1,2,ZHANG Yanjun1,2,SU Rui1,2,LIU Zhihong1,2,WANG Ruijun1,2,LI Jinquan1,2(1.School of Animal Science,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot 010018,China;2.Key Laboratory of Animal Genetics,Breeding and Reproduction,Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018,China)

Using RT-PCR andin situhybridization method to checkMTNR1amRNA expression localization in hypothalamus,pituitary and ovary of Inner Mongolian cashmere goats.It turned out that MTNR1aexpressed in hypothalamus,pituitary and ovary of Inner Mongolian cashmere goats,in addition,there were a stronger expression signal in the hypothalamus and pituitary,the expression signal could be seen in thecal cells of ovary.Therefore,hypothalamus,ovary and pituitary were the target organs of melatonin.It also showed melatonin,which combined with target organs'receptor gene,affected reproductive performance of Inner Mongolian cashmere goats,which laid a foundation for making a further explore to the pathway,regulation and control mechanism with melatonin.

MTNR1a;cashmere goats;hypothalamus;pituitary;ovary;expression;RT-PCR;in situ hybridization

S827.913.4；Q786

A

1005-9369（2014）05-0092-05

2013-11-26

國家自然科學基金項目（31160447，30760163）；內(nèi)蒙古自然基金項目（2013MS0417）

趙艷紅（1967-），女，副教授，博士，研究方向為絨山羊遺傳育種與繁殖。E-mail:13947196432@163.com

時間2014:01:07[URL]http://w40512.0901.014.html

趙艷紅,王琳,張鐵佳,等.MTNR1a基因在內(nèi)蒙古絨山羊下丘腦、垂體及卵巢中的表達[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2014,45(5): 92-96.

Zhao Yanhong,Wang Lin,Zhang Tiejia,et al.Expression ofMTNR1agene in hypothalamus,pituitary and ovary of Inner Mongolian cashmere goats[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(5):92-96.(in Chinese with English abstract)