翟梅枝，肖志娟，許靜，孫宇棟

（西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

ISSR和SSR體系優(yōu)化及在分析不同核桃品種遺傳多樣性上的應(yīng)用

翟梅枝，肖志娟，許靜，孫宇棟

（西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

對(duì)核桃葉總DNA進(jìn)行提取，篩選出多態(tài)性強(qiáng)重復(fù)性好的15條ISSR引物和12對(duì)SSR引物。利用ISSR和SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)不同核桃品種遺傳多樣性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，15條ISSR引物共檢測(cè)到187個(gè)條帶，其中132個(gè)呈多態(tài)性，多態(tài)性百分比為70.59%，平均每條引物擴(kuò)增出多態(tài)性位點(diǎn)8.8個(gè)；不同品種間相似系數(shù)變化范圍為0.2500～0.7639，多態(tài)信息含量（PIC）變化范圍在0.7105～0.9151，其值均大于0.5；12對(duì)SSR共檢測(cè)到174個(gè)條帶，其中118條呈現(xiàn)態(tài)性，多態(tài)性百分比為67.82%，平均每條引物擴(kuò)增出多態(tài)性位點(diǎn)9.8個(gè)，遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.1594～0.8036，多態(tài)信息含量（PIC）變化范圍在0.7422～0.8962，平均值為0.8150，其值均大于0.5。用Mantel檢測(cè)對(duì)兩種標(biāo)記結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析（r=0.6257，P=1），表明本研究中ISSR標(biāo)記和SSR標(biāo)記的相關(guān)性顯著?；贗SSR和SSR綜合后數(shù)據(jù)遺傳相似性系數(shù)的UPGMA聚類結(jié)果表明，在遺傳相似系數(shù)閾值0.39，可將供試材料分成四大類。研究結(jié)果顯示，供試材料遺傳資源豐富，可作為育種來源。

核桃；ISSR；SSR；體系優(yōu)化；遺傳多樣性

核桃屬（Juglans）植物約有20多種，分4個(gè)組，包括核桃組（Sect.Juglans）、核桃楸組（Sect.Cardiocaryon）、黑核桃組（Sect.Rhysocayon）和灰核桃組（Sect.Trachycaryon）。核桃在中國(guó)栽培范圍最廣，種質(zhì)資源豐富。由于其在地形、氣候等不同生態(tài)環(huán)境條件下，經(jīng)長(zhǎng)期異花授粉、自然選擇和人工雜交，導(dǎo)致其遺傳背景復(fù)雜多樣，不同種質(zhì)在抗性、豐產(chǎn)性及果實(shí)品質(zhì)和形態(tài)特征等方面都存在顯著差異。

對(duì)核桃種質(zhì)資源的研究多依靠形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、酶學(xué)等手段。近年來，DNA分子標(biāo)記由于具有多態(tài)性高、不受組織類別、發(fā)育時(shí)期和環(huán)境條件影響的優(yōu)點(diǎn)，越來越多地應(yīng)用于核桃種質(zhì)資源研究。吳燕民等用RAPD標(biāo)記研究核桃屬各種之間的親緣關(guān)系[1]。徐鄭利用AFLP技術(shù)和RAPD技術(shù)分析秦巴山區(qū)及四川西部高原核桃遺傳多樣性，認(rèn)為核桃類群遺傳多樣性豐富，遺傳結(jié)構(gòu)復(fù)雜。王正加等用RAPD技術(shù)對(duì)90個(gè)來自3個(gè)大別山山核桃單株的種群間和種群內(nèi)的遺傳變異及遺傳多樣性進(jìn)行研究，認(rèn)為山核桃種群內(nèi)有較豐富的遺傳資源[2]。國(guó)外學(xué)者利用形態(tài)學(xué)、等位酶及RFLP標(biāo)記對(duì)歐洲及亞洲的核桃居群分析比較[3-5]。ISSR和SSR是近年發(fā)展起來的分子標(biāo)記技術(shù)。Daniel等用ISSR標(biāo)記技術(shù)，通過計(jì)算遺傳距離用Neighborjoining方法繪制美國(guó)南部黑核桃組48個(gè)品種的樹狀遺傳關(guān)系圖并分析其親緣關(guān)系[6]。Pollegioni等利用ISSR、SSR和RAPD技術(shù)分析意大利維琴察市的天然雜交種、黑核桃和核桃的遺傳多樣性[7]。王滑等利用SSR標(biāo)記揭示我國(guó)核桃和鐵核桃天然居群的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)，為其遺傳資源保護(hù)、可持續(xù)利用和遺傳改良提供科學(xué)依據(jù)[8]。本研究運(yùn)用ISSR和SSR分子標(biāo)記對(duì)西北農(nóng)林科技大學(xué)核桃資源圃內(nèi)的18份核桃材料進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，以期為雜交育種中親本選擇及種質(zhì)創(chuàng)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料的采集和處理

2012年4 月初，采集西北農(nóng)林科技大學(xué)核桃資源圃內(nèi)18個(gè)核桃材料的嫩葉（見表1），低溫冷藏帶回實(shí)驗(yàn)室，放入-80℃冰箱中保存待用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取與檢測(cè)

采用改良的CTAB法提取DNA，并用RNA酶對(duì)其純化。用分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA濃度與質(zhì)量。獲得濃度和純度符合要求的DNA，將其稀釋至100 ng·μL-1，存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

DNA質(zhì)量濃度（ng·μL-1）=A260×50×稀釋倍數(shù)

1.2.2 引物的篩選和退火溫度的確定

通過查閱文獻(xiàn)得到31條ISSR引物，27對(duì)SSR引物[9]，皆由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。選用西洛3號(hào)、綠香和藝核1號(hào)3個(gè)品種對(duì)合成的31條ISSR引物和27對(duì)SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增，分別篩選出擴(kuò)增條帶穩(wěn)定、清晰且多態(tài)性好的ISSR引物和SSR引物，確定各引物退火溫度。

1.2.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)和電泳檢測(cè)

ISSR-PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，40～56℃退火30 s，72℃延伸60 s，32個(gè)循環(huán)；72℃后延伸10 min，最后4℃保存。SSR-PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，45°C退火30 s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃后延伸5 min，最后4℃保存。

ISSR引物擴(kuò)增的產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL 6×Loading buffer混勻后上樣，用1×TBE電泳緩沖液，在恒定120 v電壓下電泳2 h，放入EB中染色10 min后，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行照相。SSR引物擴(kuò)增產(chǎn)物采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)：250 v預(yù)電泳30 min后，在5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1μL 6× Loading buffer，混勻后上樣，用1×TBE電泳緩沖液，在恒定250 v電壓下電泳3 h，用1%硝酸銀染色后，再經(jīng)過15%NaOH顯色拍照。

表1 供試核桃品種名稱及來源Table 1 Name and origin of walnuts variety collected in this study

1.2.4 PCR反應(yīng)體系的正交試驗(yàn)

體系優(yōu)化采用L16（45）正交設(shè)計(jì)，5個(gè)因素為Mg2+、dNTP、Taq酶、引物濃度、模板DNA，共16個(gè)反應(yīng)體系。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。由于PCR反應(yīng)體系中各個(gè)因素，如Mg2+、Taq酶、dNTP、模板DNA和引物濃度直接影響到擴(kuò)增效率，進(jìn)而影響試驗(yàn)結(jié)果，因此有必要對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。用20 μL的反應(yīng)體系，Buffer均為2 μL，不足20 μL ddH2O補(bǔ)足，重復(fù)3次。ISSR和SSR反應(yīng)體系見表3、4。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

以DM2000為標(biāo)準(zhǔn)，同一個(gè)引物擴(kuò)增后，經(jīng)過電泳，凝膠上同一位置上的條帶可認(rèn)為屬于同一位點(diǎn)且具有同源性，每個(gè)條帶視為一個(gè)標(biāo)記[10]。故根據(jù)條帶的有無記錄數(shù)據(jù)，有條帶的記錄1，無條帶的記錄0，經(jīng)NT-SYSpc2.1[11]軟件分析得出遺傳相似系數(shù)（GS）和樹狀圖。

表2 PCR反應(yīng)體系中處理因素和水平Table 2 Levels and factors of PCR reaction system treatments

表3 ISSR最佳反應(yīng)體系(20 μL)Table 3 Optimum system of ISSR(20 μL)

表4 SSR最佳反應(yīng)體系(20 μL)Table 4 Optimum system of SSR(20 μL)

式中，Ni為供試樣品i中出現(xiàn)的擴(kuò)增片段個(gè)數(shù)，Nj為供試材料j中出現(xiàn)的擴(kuò)增片段個(gè)數(shù)，Nij為供試材料i和j共有的擴(kuò)增片段個(gè)數(shù)。用SAHN程序中的UPGMA方法進(jìn)行聚類分析。

多態(tài)信息含量（Polymorphism information content，PIC）[12]是表示DNA變異程度的指標(biāo)，反應(yīng)DNA多態(tài)高低，位點(diǎn)的PIC值均大于0.50，表明具有較高的多態(tài)信息量，在核桃組內(nèi)遺傳分析中有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。當(dāng)PIC值>0.5時(shí)，標(biāo)記具有高度可供信息性；0.50>PIC>0.25時(shí)，標(biāo)記能夠較合理的提供信息；PIC值<0.25時(shí)，標(biāo)記可供信息性差。其計(jì)算公式如下：

式中，Pi、Pj分別為群體中第i、j個(gè)等位基因頻率，n為等位基因數(shù)。

用TFPGA軟件里的Mantel-test對(duì)ISSR和SSR兩種分子標(biāo)記的遺傳相似系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR優(yōu)化體系的建立及應(yīng)用

用篩選出來的15條引物對(duì)18個(gè)供試材料進(jìn)行擴(kuò)增，把在凝膠上有同一遷移率的條帶作為一個(gè)同源位點(diǎn)，ISSR共檢測(cè)到187個(gè)條帶，其中132個(gè)條帶呈現(xiàn)多態(tài)性，多態(tài)百分比為70.59%，其中擴(kuò)增多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)最少的是ISSR812和ISSR844引物，均為6條；最多的是ISSR14引物，為17條。平均每條引物擴(kuò)增出多態(tài)性位點(diǎn)8.8個(gè)，分子質(zhì)量100～2 000 bp。不同供試材料間相似系數(shù)變化范圍0.2500～0.7639，多態(tài)信息含量（PIC）變化范圍在0.7105～0.9151，其值均大于0.5，說明ISSR的15條引物擴(kuò)增位點(diǎn)均表現(xiàn)出高度多態(tài)，15條ISSR引物特征及擴(kuò)增結(jié)果見表5。由表5可知，所篩選的15條ISSR引物退火溫度除ISSR12和ISSR844，其他引物退火溫度都在50～55℃。較高的退火溫度，增強(qiáng)了試驗(yàn)的可重復(fù)性[13]。

引物ISSR841擴(kuò)增后電泳圖譜見圖1。

2.2 SSR優(yōu)化體系的建立及應(yīng)用

用篩選出的12對(duì)SSR引物對(duì)18個(gè)供試材料進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小大多在100～500 bp之間。SSR共檢測(cè)到174個(gè)條帶，其中118條呈現(xiàn)多態(tài)性，多態(tài)百分比為67.82%，引物WGA33擴(kuò)增的條帶數(shù)最多，為17條；引物ZMZ44次之，為15條。引物WGA82、ZMZ31和ZMZ45擴(kuò)增譜帶數(shù)最少，均為6條。平均每條引物擴(kuò)增出多態(tài)性位點(diǎn)9.8個(gè)，遺傳相似系數(shù)0.1594～0.8036，多態(tài)信息含量（PIC）變化在0.7422～0.8962，平均值為0.8150，其值均大于0.5，說明SSR的12對(duì)引物擴(kuò)增位點(diǎn)均表現(xiàn)出高度多態(tài)性（見表6）。

表5 15條ISSR引物的特征及擴(kuò)增結(jié)果Table 5 Characteristics of 15 pairs of ISSR primers and PCR results

圖1 ISSR引物841對(duì)18份供試材料的擴(kuò)增電泳Fig.1 Electrophoresis pattern amplified from 18 tested materials with ISSR primer 841

對(duì)SSR的27對(duì)引物進(jìn)行退火溫度的探索，用PCR儀的梯度功能，在40～56℃內(nèi)8個(gè)梯度進(jìn)行擴(kuò)增，各個(gè)引物的Tm均包含在其中。選用形態(tài)差異大的西洛3號(hào)，藝核1號(hào)和綠香3個(gè)核桃品種進(jìn)行擴(kuò)增試驗(yàn)（見表6）。由表6可知，基于SSR的引物采用不同的退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增后，結(jié)果表明差異不明顯，因此均采用45℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

引物ZMZ31擴(kuò)增后的電泳圖譜見圖2。

2.3 ISSR和SSR數(shù)據(jù)綜合后的遺傳相似系數(shù)分析

18個(gè)供試材料間的遺傳相似系數(shù)見表7。由表

7可以看出，18個(gè)供試品種（優(yōu)系）中，實(shí)生類型的優(yōu)良株系間相似系數(shù)最大。實(shí)生優(yōu)系2和3的相似系數(shù)達(dá)0.8889，實(shí)生優(yōu)系1和2、3的相似系數(shù)分別達(dá)0.7789、0.8454。在供試的15個(gè)優(yōu)良品種中，吐萊爾與實(shí)生優(yōu)系的相似程度最大。吐萊爾與實(shí)生優(yōu)系1、2、3的相似系數(shù)分別為0.7237、0.7802、0.7917，故推斷吐萊爾與3個(gè)實(shí)生優(yōu)系親緣關(guān)系較近。品種間西林3號(hào)和清香之間的遺傳相似系數(shù)最大，為0.7698；W06-1和藝核1號(hào)之間的遺傳相似系數(shù)最小，為0.2642。綜上可知，18個(gè)供試核桃品種（優(yōu)系）遺傳多樣性豐富，可作為育種材料進(jìn)行雜交育種和新種質(zhì)創(chuàng)制。

表6 參試12對(duì)SSR引物的特征及擴(kuò)增結(jié)果Table 6 Characteristics of 12 pairs of SSR primers and PCR results

圖2 引物ZMZ31對(duì)18份供試材料的ISSR擴(kuò)增電泳Fig.2 Electrophoresis pattern amplified from 18 tested materials with primer ZMZ31

表7 基于ISSR和SSR的供試樣品的相似系數(shù)Table 7 Genetic similarity of 18 walnuts aeeessions based on ISSR and SSR

2.4 ISSR和SSR綜合聚類分析

用軟件NSTYS-PC進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算出18個(gè)供試材料的遺傳相似系數(shù)，利用不加權(quán)成對(duì)算術(shù)平均法（UPGMA）對(duì)供試材料進(jìn)行聚類分析得到樹狀圖（見圖3）。NSTYS-PC數(shù)據(jù)分析顯示，樹狀圖的r值為0.8332，在0.8～0.9之間，說明此進(jìn)化樹符合較好。在遺傳相似系數(shù)閾值0.39可將供試材料分成4大類。第1類：12個(gè)，分別為西林2號(hào)、西林3號(hào)、遼寧4號(hào)、新疆2號(hào)、香玲、S1、S2、S3、吐萊爾、溫185、西洛3號(hào)和清香；第2類：2個(gè)，分別為維納、契可，均來自美國(guó)；第3類：3個(gè)，W06-1，青林和綠香，均來自山東；第4類：1個(gè)，藝核1號(hào)，為文玩核桃，與普通栽培品種差異較大，故單獨(dú)列為一組。

圖3 18個(gè)核桃品種（優(yōu)系）的遺傳多樣性樹狀圖Fig.3 Dendrogram of 18 walnut varieties based on ISSR genetic similarity

3 討論與結(jié)論

3.1 ISSR和SSR標(biāo)記PCR比較

比較優(yōu)化的ISSR和SSR標(biāo)記擴(kuò)增程序，其中擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)和退火溫度是影響PCR的主要因素。ISSR和SSR引物長(zhǎng)度相當(dāng)，但I(xiàn)SSR退火溫度一般在46.0～54.9℃，而SSR退火溫度一般在45℃。退火溫度ISSR比SSR高很多，錯(cuò)配較少。ISSR和SSR分子標(biāo)記的循環(huán)數(shù)相近，分別是32個(gè)循環(huán)和30個(gè)循環(huán)，均可擴(kuò)增出清晰明亮的條帶，循環(huán)數(shù)多將增加錯(cuò)誤摻入的幾率。

3.2 ISSR和SSR標(biāo)記結(jié)果一致性分析

對(duì)兩者相似系數(shù)矩陣的相關(guān)性進(jìn)行Mantel檢驗(yàn)（r=0.6257，P=1）。結(jié)果表明，兩種標(biāo)記方法相關(guān)性顯著，但并不完全一致，造成ISSR和SSR標(biāo)記結(jié)果差異的原因多種多樣，與兩種標(biāo)記方法的多態(tài)性檢測(cè)位點(diǎn)未能覆蓋全基因組有關(guān)，ISSR和SSR兩種分子標(biāo)記的原理不同，揭示的基因組范圍不同，不同標(biāo)記得出不同的遺傳相似系數(shù)。以多種分子標(biāo)記及形態(tài)學(xué)標(biāo)記相結(jié)合的手段，對(duì)目標(biāo)植物進(jìn)行遺傳多樣性研究，可得到更為準(zhǔn)確的結(jié)果。

[1]吳燕民,裴東,奚聲珂.運(yùn)用RAPD對(duì)核桃屬種間親緣關(guān)系的研究[J].園藝學(xué)報(bào),2000,27(1):17-22.

[2]王正加,黃有軍,郭傳友.大別山山核桃種群遺傳多樣性研究[J].植物生態(tài)學(xué)報(bào),2006,30(3):534-538.

[3]Malvolti M E,Fineschi S,Pigliucci M.Morphological integration and genetic variability inJuglansregia L.[J].J Hered,1994,85: 389-394.

[4]Malvolti M E,Paciucci M,Cannata F,et al.Genetic variation in Italian populations ofJuglansregia L[J].Acta Hortic,1993,311: 86-94.

[5]Fjellstrom R G,Parfitt D E.Walnut(Juglansspp.)genetic diversity determined by restriction fragment length polymorphisms[J]. Genome,1994,37:690-700.

[6]Daniel,Fangyou-Gao,Bagget,et al.Defining the sources of Paradox:DNA sequence markers for North American walnut (Juglans.regia L.),species and hybrids[J].Scientia Horticulturae, 2002(12):157-170.

[7]Pollegioni P,Major A,Bartoli S,et al.Application of microsatellite and dominant molecular markers for the discrimination of species and interspecific hybridsingenusJuglans[J].Acta Horticulturae Sinica,2005,705:191-199.

[8]王滑,郝俊民,王寶慶.中國(guó)核桃8個(gè)天然居群遺傳多樣性分析[J].林業(yè)科學(xué),2007,43(7):120-124.

[9]Woeste K,Rhodes R B O,Michler C.Thirty polymrophicnuclear microsatellite loci from black Walunt[J].The Journal of Heredity, 2002.93:58-60.

[10]AiC X,Li G T,Zhang L S,et al．Study on the Genetic Diversity of Natural Chestnut Population sin Shandong Chinaby SSR Markers [J].Acta Hort,2009,844:257-266.

[11]RohlF F J．NTSYS-pc numerical taxonomy and multivariate analysis system,version 2.1[M]．New York:Exeter Pub,2000.

[12]Bostein D,White R L,Skolnick M,et al.Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J].Am J Hum Genet,1980,32:314-331.

[13]杜娟,南宮自艷,周國(guó)娜.美國(guó)白蛾SSR反應(yīng)體系的優(yōu)化與初步應(yīng)用[J].林業(yè)科學(xué),2010,46(3):173-177,29．

[14]劉曉麗,何天明,張美勇.核桃SSR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J].果樹學(xué)報(bào),2007(2):140-145．

ISSR and SSR system optimization and application on genetic diversity analyzing of walnut

ZHAI Meizhi,XIAO Zhijuan,XU Jing,SUN Yudong
(School of Forestry,Northwest Agriculture and Forestry University,Yangling Shaanxi 712100,China)

In this study,ISSR and SSR molecular marker technologies were selected to analyze the genetic diversity of different walnut varieties to provide a theoretical basis for the future development of new varieties and germplasm innovation.Total 15 ISSR primers and 12 SSR primers with good repeatability and strong polymorphism were screened and the PCR optimum system was set up.ISSR molecular mark detected 187 bands,of which 132 were polymorphism bands,accounting for 70.59%, and the number of the polymorphic loci of each primer averaged 8.8.The similarity coefficient ranged from 0.2500 to 0.7639.Polymorphic information content(PIC)ranged from 0.7105 to 0.9151,and each value was greater than 0.5.SSR molecular mark detected 174 bands,of which 118 were polymorphism bands,accounting for 67.82%,and the number of the polymorphic loci of each primer averaged 9.8.The similarity coefficient ranged from 0.1594 to 0.8036.Polymorphic information content(PIC)ranged from 0.7422 to 0.8962,and each value was greater than 0.5.Mantel test was used to analyse correlation of ISSR and SSR(r=0.6257,P=1),indicated that ISSR markers and SSR markers in this study was consistent.Cluster analysis with UPGMA method showed that the samples could be divided into four groups.It showed that the genetic resources of these samples were very rich,and could be used as breeding source.

walnut;ISSR;SSR;system optimization;genetic diversity

S664.1

A

1005-9369（2014）01-0090-08

2013-07-18

公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201004027）；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃（2012KTZB02-01）

翟梅枝（1963-），女，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榻?jīng)濟(jì)林及其資源利用。E-mail:plum-zhai@163.com

時(shí)間2014-1-10 6:28:40[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140110.0628.005.html

翟梅枝,肖志娟,許靜,等.ISSR和SSR體系優(yōu)化及在分析不同核桃品種遺傳多樣性上的應(yīng)用[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45 (1):90-97.

Zhai Meizhi,Xiao Zhijuan,Xu Jing,et al.ISSR and SSR system optimization and application on genetic diversity analyzing of walnut[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(1):90-97.(in Chinese with English abstract)