姜景彬，劉曉東，許向陽，陳秀玲，李景富

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030）

番茄抗黃化曲葉病毒基因Ty-3的AFLP標記

姜景彬，劉曉東，許向陽，陳秀玲，李景富*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030）

以感病材料10981為父本（P1），抗病材料10032為母本（P2），通過自交、雜交和回交，獲得P1、P2兩個親本和F1、F2、BC1及BC2群體，接種鑒定各世代發(fā)病情況。選用288對Eco RⅠ/MseⅠ引物組合對P1、P2兩個親本，F(xiàn)1和F2代群體進行AFLP分析?？ǚ綔y驗結(jié)果表明，抗源材料10032對黃化曲葉病毒的抗性表現(xiàn)為單基因顯性遺傳。經(jīng)AFLP引物篩選及遺傳連鎖分析，獲得與抗病基因Ty-3緊密連鎖的標記E40/M49，遺傳距離為3.4 cM。該研究可為番茄抗TYLCV分子標記輔助選擇和抗TYLCV育種奠定基礎(chǔ)。

番茄黃化曲葉病毒；Ty-3；AFLP；遺傳距離

番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）屬于雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus），是一類通過煙粉虱（Bemlsiatobaci）傳播，含孿生顆粒形態(tài)單鏈環(huán)狀DNA的植物病毒[1-2]。1964年Cohen和Harpaz首次發(fā)現(xiàn)番茄黃化曲葉病毒[3]。目前，番茄黃化曲葉病毒已擴展到非洲、中東、東南亞、地中海、中美洲、澳大利亞、日本、印度、墨西哥、加勒比海，以及美國的佛羅里達州、加州等地區(qū)[4-8]。我國浙江、上海、廣西、云南、江蘇、河南、廣東、福建、山東、海南和臺灣等地區(qū)也相繼發(fā)生番茄黃化曲葉病毒危害，使番茄生產(chǎn)遭受嚴重損失。

分子標記的多樣化給番茄抗病基因定位帶來不同研究手段，AFLP、RAPD等分子標記在番茄抗黃化曲葉病毒病抗性基因的研究上取得進展，LA2779和LA1932材料中發(fā)現(xiàn)G8基因，序列不同，分別命名為Ty-3和Ty3-a，但Ty-3基因的遺傳規(guī)律和連鎖機制尚不明確。本文利用含有Ty-3抗病基因的抗病材料10032和感病材料10981，構(gòu)建6個世代群體，通過田間抗病性鑒定和AFLP分子標記方法，確定抗病基因Ty-3的遺傳規(guī)律和連鎖機制，可為抗番茄黃化曲葉病分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

抗病親本10032和感病親本10981，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄研究所提供。對兩個親本進行有性雜交獲得F1，F(xiàn)1自交獲得F2，F(xiàn)1分別與P1和P2回交分別獲得BC1和BC2。

1.2 番茄黃化曲葉病毒病抗病性鑒定

病毒采自浙江杭州和海寧地區(qū)的番茄植株，毒源通過煙粉虱傳毒繁殖保存于防蟲溫室。采集溫室中經(jīng)煙粉虱接種的番茄葉片，-20℃保存?zhèn)溆?。采用煙粉虱侵染接種法，P1、P2、F1、F2、BC1、BC2的抗病性鑒定在營養(yǎng)缽中進行，設(shè)置3次重復(fù)。P1、P2和F1每個重復(fù)種植30株；F2為分離群體，則每個重復(fù)種植90株，BC1和BC2每個重復(fù)種植30株，重復(fù)內(nèi)各組合隨機排列。接種后不定期調(diào)查番茄秧苗發(fā)病情況，并于接種后20 d，感病親本已充分發(fā)病時逐株調(diào)查各株的發(fā)病情況，計算發(fā)病株率和病情指數(shù)；按照申書興方法進行發(fā)病嚴重度分級[9]：0級-無癥狀；1級-明脈、葉片輕黃化；3級-葉片黃化、邊緣上卷；5級-葉片重黃化、皺縮、少數(shù)葉片畸形；7級-葉片重黃化、畸形縮小，植株明顯矮化；9級-葉片嚴重畸形縮小，植株嚴重矮化，甚至枯死。根據(jù)通用的番茄病毒病群體分級標準[10]將各世代番茄秧苗分為：免疫-I，不表現(xiàn)癥狀，病情指數(shù)為0；高抗-HR，0<病情指數(shù)≤2；抗病-R，2<病情指數(shù)≤15；中抗-MR，15<病情指數(shù)≤30；感病-S，30<病情指數(shù)≤100；并將I、HR、R以及MR歸為抗病，將S歸為感病，然后進行抗病性遺傳適合性測驗，確定抗病親本的抗病性遺傳規(guī)律。

1.3 AFLP標記

1.3.1 DNA的提取及BSA分池

采用改良的CTAB法提取DNA，在F2群體中隨機選取10株高抗單株和10株高感單株的DNA混合成抗病池（R1）和感病池（S2）。

1.3.2 酶切與連接

25 μL體系，其中10×Buffer 2.5 μL、DNA 1 μL、ATP（10 mmol·L-1）0.5 μL、Eco RⅠadapter（5 pmol·μL-1）0.5 μL、MseⅠadapter（50 pmol·μL-1）0.5 μL、Eco RⅠ（10 U·μL-1）0.25 μL、MseⅠ（10 U·μL-1）0.25 μL、T4DNA Ligase（5 U·μL-1）0.3 μL；混勻，37℃酶切與連接12 h或過夜。

1.3.3 酶切連接產(chǎn)物預(yù)擴增

預(yù)擴增體系為20 μL，其中酶切連接產(chǎn)物DNA 4.0 μL；10×Buffer 2.0 μL；MgCl21.2 μL；dNTP（2.5 mmol·L-1）1.6 μL；E00（50 ng·μL-1）0.6 μL；M00（50 ng·μL-1）0.6 μL；Taq DNA polymerase（5 U·μL-1）0.2 μL；PCR程序為94℃3 min；94℃30 s；56℃30 s；72℃1 min；72℃10 min；24個循環(huán)，4℃保存。取4 μL預(yù)擴產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖中檢測預(yù)擴增結(jié)果。

1.3.4 預(yù)擴產(chǎn)物選擇性擴增

選擴體系為20 μL，其中10×Buffer 2.0 μL；DNA（預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋30×）5.0 μL；MgCl2（25 mmol·L-1）1.2 μL；dNTP（2.5 mmol·L-1）1.6 μL；Exx（50 ng·μL-1）1.0 μL；Mxx（50 ng·μL-1）1.0 μL；Taq DNA polymerase（5 U·μL-1）0.2 μL；PCR程序為94℃變性3 min；94℃變性30 s；65℃退火30 s；72℃延伸1 min；共12個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度降低0.7℃；之后94℃變性30 s；56℃退火30 s；72℃延伸1 min；共26個循環(huán)，每個循環(huán)退火時間加1 s；72℃10 min，4℃保存。取5 μL選擴產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖中檢測預(yù)擴增結(jié)果。

1.3.5 擴增產(chǎn)物變性處理

在選擇性擴增產(chǎn)物中加入30%～40%的Loading Buffer，PCR儀中95℃變性5 min，然后立即置于冰水混合物中。

1.3.6 聚丙烯酰胺凝膠電泳

選擴產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，電泳液為1×TBE溶液，恒定功率80 W，預(yù)電泳30 min。取5 μL變性產(chǎn)物進行點樣，65 W恒定功率1.5 h，電泳后進行銀染。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間各世代抗病情況

為了研究Ty-3基因的遺傳規(guī)律，待感病親本充分發(fā)病后開始調(diào)查，調(diào)查結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明感病親本P1全部發(fā)?。豢共∮H本P2中89株未發(fā)病，1株發(fā)病為1級；F1代87株未發(fā)病，1株發(fā)病為1級，1株發(fā)病為5級；F2代中204株發(fā)病在1級及1級以下，62株發(fā)病在5級以上；BC1中發(fā)病程度在3級及3級以下的有47株，5級及5級以上的有43株；BC2中發(fā)病程度均在1級及1級以下。從而得出，回交世代呈1∶1，F(xiàn)2群體呈3∶1分離比例。對表中數(shù)據(jù)進行經(jīng)卡方檢驗，結(jié)果表明人工接種鑒定，實得卡方值分別為0.363和0.1均小于X20.05= 3.841，符合單基因顯性遺傳特性。

2.2 AFLP引物篩選

為了研究番茄黃化曲葉病毒病基因Ty-3的連鎖機制，本試驗采用288對Eco RⅠ/MseⅠ引物組合對親本及由F2代建立的抗感池進行AFLP標記篩選（見圖1），尋找與目的基因緊密連鎖的引物組合，最終篩選出11對多態(tài)性好、差異明顯且穩(wěn)定性高的引物，分別是E35/M61、E36/M36、E36/ M47、E36/M48、E36/M50、E51/M37、E38/M61、E40/M47、E40/M49、E41/M49、E41/M59。

表1 苗期人工接種條件下番茄黃化曲葉病毒病抗性遺傳的適合性測驗Table 1 Chi-square test for resistant trait inheritance to TYLCV after inoculation

圖1 10981×10032群體篩選出的部分AFLP特異引物Fig.1 Screened AFLP primers on 10981×10032 population

2.3 F2代單株P(guān)CR擴增

以10032×10981群體的267個F2單株DNA的預(yù)擴增產(chǎn)物為模板，再將已篩選出的11對引物進行選擇性擴增，然后用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，并記錄譜帶。

結(jié)果見圖2。

圖2 引物E40/M49在部分F2單株中的擴增結(jié)果Fig.2 Amplified products on AFLP primer of E40/M49 on partial F2population

2.4 連鎖分析及遺傳距離的確定

利用MAPMAKE 3.0軟件對分離群體單株的抗病性表現(xiàn)和分子標記的分離數(shù)據(jù)進行連鎖分析，得出遺傳距離（cM）。結(jié)果表明，E40/M49、E41/ M49、E36/M48與抗病基因Ty-3的連鎖遺傳距離分別為3.4、11.6、18.3 cM。

3 討論

本試驗研究結(jié)果表明，通過AFLP標記，找出與目的基因緊密連鎖的E40/M49，遺傳距離為3.4 cM。通過研究六個世代的田間抗病情況，得出本試驗材料中含有的抗番茄黃化曲葉病毒病Ty-3基因是單基因顯性遺傳。目前關(guān)于番茄對黃化曲葉病毒抗性遺傳規(guī)律的報道結(jié)論各異，主要是抗源材料來源不同，導(dǎo)致其對TYLCV抗性遺傳規(guī)律不同，或只是由于TYLCV菌株的差異和病毒的重組變異而導(dǎo)致其致病機理發(fā)生變化，相應(yīng)表現(xiàn)出不相同的抗病機制[11]，因此有的呈一對單基因顯性或部分顯性，有的呈一對隱性基因控制，有的受多基因控制的數(shù)量性狀等。Piloswsky和Cohen報道，醋栗番茄（L.pimpinellifolium）LA121、LA1478、LA1582對TYLCV的抗性是由一對不完全顯性基因控制，秘魯番茄（L.peruvianum）PI126935對TYLCV抗性為多對（5對）隱性基因控制[12]。而Hassan等認為醋栗番茄（L.pimpinellifolium）LA121和LA373的抗病性是由部分隱性基因所控制的數(shù)量性，多毛番茄（L.hirsutum）LA386對TYLCV的抗性是由一對顯性基因控制，契斯曼尼番茄（L.cheesmanii）LA1401對TYLCV抗性是由一對隱性基因控制[13]。而Vidavsky和Czosnek認為多毛番茄（L.hirsutum）LA386對TYLCV的抗病由2～3對隱性基因控制，耐病為一對顯性基因控制[14]。而Lapidot等報道，秘魯番茄PI126926、LA441抗病性由一對部分顯性基因控制[15]。Zamir等報道，智利番茄（L.chilense）LA1969、LA1932對TYLCV抗性是由一對顯性基因（Ty-1）所控制[16]。

本試驗材料10032（P2）含有的抗黃化曲葉病毒Ty-3基因是單基因顯性遺傳，與亞蔬中心報道一致。本試驗可為番茄抗黃化曲葉病毒育種奠定基礎(chǔ)，將不同抗性基因聚合到同一品種可產(chǎn)生更加穩(wěn)定持久的抗性。

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Identification of AFLP markers linked to TYLCV resistance geneTy-3 in tomato

JIANG Jingbin,LIU Xiaodong,XU Xiangyang,CHEN Xiuling,LI Jingfu
(School of Horticulture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Abstract:Through hybridization,self crossing and back cross of the resistant parent P2and susceptible parent P1,P1,F1(P1×P2),F2,BC1,and BC2were obtained.Plant disease incidence of all obtained generations was surveyed after artificial inoculation.AFLP analysis was conducted with 288EcoR I/MseI primer combinations on two parents P1,P2,F1and F2generations of resistant and susceptible gene pool.The results showed that the generation of resistant and susceptible plants showed regular distribution.The Chi-square test results showed that yellow leaf curl virus resistance gene was one dominant gene in the resistant material P2.Genetic linkage analysis of the specific bands of AFLP markers and target gene was carried on in the F2segregating population.The results showed that the specific bands E40/M49 was tightly linked to tomato yellow leaf curl virus resistant gene,and the genetic distance was 3.4 cM.This study would expedite the selection of tomato germplasm and could be used in TYLCV resistant breeding practice.

tomato yellow leaf curl virus(TYLCV);Ty-3;AFLP;genetic distance

S436.412

A

1005-9369（2014）01-0103-05

2012-03-28

“十二五”國家支撐計劃項目（2012BAD02B02-7）

姜景彬（1978-），男，農(nóng)藝師，碩士，研究方向為蔬菜遺傳育種。E-mail:jjb1248@126.com

*通訊作者：李景富，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為蔬菜遺傳育種與生物技術(shù)。E-mail:Ljf-2005@126.com

時間2014-1-10 6:23:44[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140110.0623.001.html

姜景彬,劉曉東,許向陽,等.番茄抗黃化曲葉病毒基因Ty-3的AFLP標記[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014,45(1):103-107.

Jiang Jingbin,Liu Xiaodong,Xu Xiangyang,et al.Identification of AFLP markers linked to TYLCV resistance geneTy-3 in tomato[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(1):103-107.(in Chinese with English abstract)