劉傳青，向玲娟，黃 娟，陳孝平

（武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院 綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室，湖北 武漢430074）

隨著人們對質(zhì)粒提取的濃度和純度的要求越來越高，傳統(tǒng)的質(zhì)粒提取技術(shù)因費時長、提取效率低［1－2］亟待改進(jìn)，硅基質(zhì)膜吸附柱（離心柱型）質(zhì)粒提取試劑盒的出現(xiàn)，正好解決了這一問題。硅基質(zhì)吸附材料可特異性吸附核酸DNA，使用方便、快捷，不需用有毒溶劑如苯酚、氯仿等，使得提取基因組DNA像過濾一樣簡單，其原理為：在pH值等于或低于硅基質(zhì)材料表面pKa值的高離子濃度緩沖溶液中，硅基質(zhì)材料表面負(fù)電荷減少，DNA分子所帶負(fù)電荷與其表面的斥力減小，水合程度降低，被吸附到硅基質(zhì)材料表面上［3－4］，與此同時，DNA分子與硅基質(zhì)材料表面的羥基形成氫鍵，氫鍵力遠(yuǎn)大于靜電斥力，DNA分子將牢牢吸附在硅基質(zhì)材料表面［5－7］；再用pH值高于pKa值的低離子濃度的緩沖溶液洗脫吸附在硅基質(zhì)材料表面的DNA分子，破壞其間的氫鍵，即可達(dá)到提取目的［8－9］。因此，硅基質(zhì)膜材料吸附質(zhì)粒已成為大規(guī)模分離純化DNA，去除蛋白、多糖、鹽類和有機(jī)溶劑等雜質(zhì)的通用方法［10－11］。隨著生物學(xué)大通量實驗的出現(xiàn)，對商品化核酸提取試劑盒的需求量明顯增加，而且商品化的吸附柱大都是一次性的。根據(jù)硅基質(zhì)膜材料作用原理推測通過某些溶液的處理，能恢復(fù)其吸附能力。作者在此探究了商品化質(zhì)粒提取試劑盒中吸附柱重復(fù)利用的可能性，擬為降低分子生物學(xué)實驗成本提供參考。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

含pcDNA3.1－6His－Thioredoxin－1質(zhì)粒大腸桿菌菌株，自行保存；質(zhì)粒提取試劑盒，碧云天公司；PBS緩沖溶液、大批量質(zhì)粒提取試劑，自行配制；1kb DNA ladder、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶，Takara公司。

臺式恒溫振蕩器，太倉實驗儀器廠；DYY－10C型電泳儀，北京六一儀器廠；HC－3018R型高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；暗箱式紫外分析儀，上海嘉鵬科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 pcDNA3.1－6His－Thioredoxin－1質(zhì)粒水溶液的制備

挑取含pcDNA3.1－6His－Thioredoxin－1質(zhì)粒單菌落至50mL含氨芐抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃、180 r·min－1下振蕩培養(yǎng)12～16h。用大批量質(zhì)粒提取試劑提取質(zhì)粒，用水保存質(zhì)粒。

1.2.2 吸附柱的處理

1）不同溶液

取3支吸附柱各加200μL質(zhì)粒水溶液過柱，用100μL洗脫液反復(fù)洗脫3次盡可能除去吸附柱上吸附的質(zhì)粒。將第1次過柱回收的質(zhì)粒于－20℃保存。將吸附柱分別置于離子濃度為0.01mol·L－1、pH值為7.01的PBS緩沖溶液、75%酒精溶液和雙蒸水中，于4℃保存3d和6d后取出，重新加入200μL質(zhì)粒水溶液，用100μL洗脫液洗脫，回收的質(zhì)粒與第1次過柱回收質(zhì)粒一起用XhoⅠ單酶切進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，比較不同溶液的處理效果。

2）pH值

配制不同pH值的PBS緩沖溶液（表1）。將質(zhì)粒水溶液第1次過柱后回收的質(zhì)粒于－20℃保存。將吸附柱編號對應(yīng)放入編號燒杯中，于4℃保存6d后取出，重新加質(zhì)粒水溶液再次過柱，回收的質(zhì)粒與第1次過柱回收質(zhì)粒一起用XhoⅠ單酶切進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，比較不同pH值時的處理效果。

表1 不同pH值的PBS緩沖溶液Tab.1 PBS Buffers with different pH values

3）離子濃度

配制不同離子濃度的PBS緩沖溶液（表2）。將質(zhì)粒水溶液第1次過柱后回收的質(zhì)粒于－20℃保存。將吸附柱編號對應(yīng)放入編號燒杯中，于4℃保存6d后取出吸附柱，重新加質(zhì)粒水溶液再次過柱，回收的質(zhì)粒與第1次過柱回收質(zhì)粒一起用XhoⅠ單酶切進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，比較不同離子濃度下的處理效果。

表2 不同離子濃度的PBS緩沖溶液Tab.2 PBS Buffers with different ion concentrations

4）溫度

將質(zhì)粒水溶液第1次過柱后回收的質(zhì)粒于－20℃保存。將吸附柱放入離子濃度為0.01mol·L－1、pH值為2.04的PBS緩沖溶液中，分別于常溫、4℃和－20℃保存6d后取出，重新加質(zhì)粒水溶液再次過柱，回收的質(zhì)粒與第1次過柱回收質(zhì)粒一起用XhoⅠ單酶切進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，比較不同溫度下的處理效果。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同溶液處理效果

由于質(zhì)粒存在多種形式，電泳時無法集中在同一條帶進(jìn)行分析，為了更好地比較質(zhì)粒回收的效率，將經(jīng)過不同溶液處理的吸附柱所回收的質(zhì)粒，各取10μL用XhoⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，瓊脂糖凝膠電泳分析如圖1所示。

圖1 不同溶液處理效果Fig.1 The effects treated by different solutions

從圖1可以看出：水處理在短期內(nèi)（3d）可以恢復(fù)吸附柱一定的再吸附能力，隨著時間的延長吸附柱的再吸附能力越來越弱；0.01mol·L－1PBS緩沖溶液和75%酒精溶液處理都可以恢復(fù)吸附柱一定的再吸附能力，并且0.01mol·L－1PBS緩沖溶液處理的吸附柱的再吸附能力要強(qiáng)于75%酒精溶液處理的，且其再吸附能力比吸附柱第1次吸附能力有所增強(qiáng)。用0.01mol·L－1PBS緩沖溶液處理吸附柱6d，吸附柱再吸附能力恢復(fù)效果最好。故選用0.01mol·L－1PBS緩沖溶液處理吸附柱。

2.2 pH值對吸附柱吸附能力的影響

將不同pH值的0.01mol·L－1PBS緩沖溶液處理的吸附柱回收的質(zhì)粒，各取10μL用XhoⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，瓊脂糖凝膠電泳分析如圖2所示。

圖2 pH值對吸附柱吸附能力的影響Fig.2 The effect of pH value on adsorbability of adsorption column

從圖2可以看出：pH值對吸附柱再吸附能力影響很大；低pH值有利于吸附柱恢復(fù)再吸附能力。這是因為，經(jīng)過低pH值溶液處理的吸附柱硅基質(zhì)膜表面負(fù)電荷減少，DNA分子帶有的負(fù)電荷與硅基質(zhì)膜之間的斥力減小，有利于吸附柱吸附DNA分子［6］。實驗組吸附柱經(jīng)pH值2.04的PBS緩沖溶液處理后，對DNA分子表現(xiàn)出較好的吸附效果，表明其恢復(fù)了較高的再吸附能力。故選用pH＝2.04的PBS緩沖溶液處理吸附柱。

2.3 離子濃度對吸附柱吸附能力的影響

將不同離子濃度、pH值為2.04的PBS緩沖溶液處理的吸附柱回收的質(zhì)粒，各取10μL用XhoⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，瓊脂糖凝膠電泳分析如圖3所示。

圖3 離子濃度對吸附柱吸附能力的影響Fig.3 The effect of ion concentration on adsorbability of adsorption column

從圖3可以看出：離子濃度對吸附柱的再吸附能力影響不明顯；較高的離子濃度反而對吸附柱的再吸附能力有抑制作用。實驗組只用了不同離子濃度的溶液處理吸附柱，還應(yīng)該增加對DNA分子樣品離子濃度的考察。因為高離子濃度的DNA分子樣品可以有效地降低DNA分子的水合度從而更好地驅(qū)使DNA分子與吸附柱硅基質(zhì)膜的結(jié)合［6］。用離子濃度為0.01mol·L－1的PBS緩沖溶液處理吸附柱，可以使其恢復(fù)較高的再吸附能力。故選用離子濃度為0.01mol·L－1、pH值為2.04的PBS緩沖溶液處理吸附柱。

2.4 溫度對吸附柱吸附能力的影響

將經(jīng)過不同溫度處理的吸附柱回收的質(zhì)粒，各取10μL用XhoⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，瓊脂糖凝膠電泳分析如圖4所示。

圖4 溫度對吸附柱吸附能力的影響Fig.4 The effect of temperature on adsorbability of adsorption column

從圖4可以看出：較低的溫度有利于吸附柱再吸附能力的恢復(fù)，最佳溫度為4℃。

2.5 討論

實驗中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過處理的吸附柱的再吸附能力相對于吸附柱第1次吸附能力有所增強(qiáng)，可能是吸附柱在較低溫度的低鹽高pH值的溶液中保存要比在空氣中保存更有利于提高其吸附能力，這為提高商品化質(zhì)粒提取試劑盒回收質(zhì)粒的濃度提供了一定的理論基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

為了更好地降低生物學(xué)實驗成本，對市場上質(zhì)粒提取試劑盒中吸附柱可重復(fù)利用性進(jìn)行了初步研究。探討了不同溶液、保存時間、pH值、離子濃度以及溫度對恢復(fù)吸附柱再吸附能力的影響。結(jié)果表明：使用后的吸附柱經(jīng)過一定的處理可以有效地恢復(fù)其對質(zhì)粒DNA的再吸附能力。確定最佳處理條件為：在離子濃度為0.01mol·L－1、pH值為2.04的PBS緩沖溶液中于4℃保存6d。經(jīng)過處理，吸附柱的再吸附能力相對于其第1次吸附能力有所增強(qiáng)。

［1］張寧，王鳳山.DNA提取方法進(jìn)展［J］.中國海洋藥物，2006，23（2）：40－46.

［2］祁汝峰，黃瑞.影響質(zhì)粒提取的關(guān)鍵因素及提取方法的選擇［J］.中國血液流變學(xué)雜志，2006，16（4）：530－533.

［3］黃南，程熠，連歡，等.改進(jìn)溶液Ⅱ配方可提高質(zhì)粒DNA提取的質(zhì)量及得率［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2008，37（6）：816－818.

［4］潘濤，雙衛(wèi)兵，唐彥.四種DNA提取試劑盒效果的比較［J］.實用醫(yī)技雜志，2013，20（4）：408－409.

［5］馬文麗.分子生物學(xué)實驗手冊［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，2011：44－78.

［6］藍(lán)月.二氧化硅納米粒子固相萃取全血中DNA的研究［D］.沈陽：東北大學(xué)，2009.

［7］洪敏，朱進(jìn)，伊漢東.納米材料應(yīng)用于DNA檢測領(lǐng)域的研究進(jìn)展［J］.分析化學(xué)，2011，39（1）：146－154.

［8］金杰，楊艷紅，吳克，等.二氧化硅納米材料固定中性脂肪酶的條件優(yōu)化及其特性［J］.生物工程學(xué)報，2009，25（12）：2003－2007.

［9］METCALF D，WEESE J S.Evaluation of commercial kits for extraction of DNA and RNA fromClostridium difficile［J］.Elsevier，2012，2（18）：608－613.

［10］魏群.分子生物學(xué)實驗指導(dǎo)［M］.北京：高等教育出版社，2007：78－85.

［11］張李娜，郭志慧，鄭行望，等.生物親和性殼聚糖－二氧化硅復(fù)合納米粒子的合成及其吸附DNA特性研究［J］.化學(xué)學(xué)報，2011，69（20）：2486－2492.