于興燕 于東紅＊ 楊景欣

（1蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科，蚌埠醫(yī)學院病理學教研室，安徽233004；2山東省棗莊市嶧城區(qū)中醫(yī)院內(nèi)科，棗莊277300）

胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其浸潤和轉(zhuǎn)移是決定預后的關鍵因素，故研究胃癌的浸潤與轉(zhuǎn)移的分子機制具有重要意義。Ezrin（埃慈蛋白）又稱細胞絨毛蛋白，為膜－細胞骨架蛋白連接蛋白，與根蛋白、膜突蛋白共同構成ERM蛋白家族［1］。他們在胞質(zhì)中起交叉連接膜與肌動蛋白骨架的作用，從而在細胞的移動和細胞形態(tài)發(fā)生中起著重要的作用［2］。Ezrin具有調(diào)節(jié)細胞骨架肌動蛋白，調(diào)整細胞形狀、粘附和活性，參與信號轉(zhuǎn)導途徑等功能［3］。幽門螺桿菌是引起慢性胃炎、胃潰瘍、胃黏膜相關淋巴瘤（MALT）的主要致病菌，并與胃癌的發(fā)生直接相關，被WHO定為一級致癌物［4］。它在不利于其生長繁殖的環(huán)境中易發(fā)生細胞壁缺陷而形成幽門螺桿菌L型（Helicobacter pylori L－form，Hp－L），目前國內(nèi)外對Hp－L感染與胃癌關系的研究較少，其感染在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用尚不清楚［5］。本實驗通過對胃癌組織及正常胃粘膜組織中Hp－L感染和Ezrin蛋白、mRNA表達的檢測，探討Ezrin及Hp－L型在胃癌浸潤轉(zhuǎn)移中的作用及二者的關系。

材料和方法

1．標本

（1）收集2010年1月至2011年10月間，蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科存檔的胃癌手術切除組織蠟塊80例。所有蠟塊經(jīng)重新切片復查，術前未經(jīng)任何抗癌治療。其中男性50例，女性30例，年齡36～80歲，中位年齡58歲。根據(jù)2003年世界衛(wèi)生組織腫瘤分類及診斷標準（WHO，2003版）又將該組病例分為低分化30例、中分化21例、高分化29例；根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（UICC）公布的TNM分期標準（2002年，第6版）將該組病例分為Ⅰ期15例、Ⅱ期13例、Ⅲ期25例、Ⅳ期27例；浸潤至漿膜的60例，未浸潤至漿膜的20例；有淋巴結轉(zhuǎn)移的60例，無淋巴結轉(zhuǎn)移的20例在該組病例中，隨機選取40例胃癌兩端切緣組織作為正常對照組，標本經(jīng)病理組織學證實。所有標本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，做HE染色、革蘭染色及免疫組織化學染色。（2）收集2012年2月至2012年5月蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院胃癌手術切除的新鮮組織標本30例及其相應的新鮮的遠端正常組織（距腫瘤邊緣組織約5cm處），患者術前均未經(jīng)過放、化療治療。所有胃癌及遠端正常組織均在離體30min內(nèi)切取，迅速放入液氮中，然后移入－80℃冰箱保存。其中男性16例，女性14例，年齡45－72歲，中位年齡58歲，患者臨床資料完整，病理資料重新經(jīng)過2名病理主治醫(yī)師復習，隨后按2003版的WHO中胃癌組織學分級標準進行組織學分級。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（UICC）公布的TNM分期標準（2002年，第6版）進行分期。

2．方法

2．1Hp－L型檢測

組織切片經(jīng)革蘭染色油鏡（×1000）觀察并計數(shù)，每例隨機觀察10－15個不同視野，取其平均數(shù)，L型和Hp均數(shù)≥20為陽性，＜20或未查見L型和Hp為陰性。革蘭染色陰性呈紅色，陽性呈紫紅色。L型形態(tài)多樣，大小不等，有巨形體、圓球體、短桿狀等，革蘭染色一般為陰性，少量表現(xiàn)為陽性（由于細胞壁的缺陷，L型增加了對結晶紫的親和力，故革蘭染色有的呈現(xiàn)紫紅色即革蘭染色陽性）。Hp呈螺旋形、“S”形或海鷗形，革蘭染色為陽性。每例同時用抗Hp－L抗體（蚌埠醫(yī)學院微生物教研室制備）進行免疫組織化學Elivision法染色，工作濃度為1∶100。用已知Hp－L型陽性切片作為陽性對照，PBS替代一抗作為陰性對照，其余按說明書操作。胃癌細胞、正常胃黏膜上皮細胞及間質(zhì)巨噬細胞的胞質(zhì)或胞膜著棕黃色細顆粒為Hp－L型抗原表達陽性。革蘭染色L型檢出和免疫組化Hp－L型抗原表達同時陽性者定為Hp－L型感染陽性。

2．2Ezrin檢測 （1）免疫組織化學Elivision法：Ezrin鼠抗人單克隆抗體及Elivision試劑盒均購自福州邁新生物技術有限公司，按試劑盒說明書操作，PBS替代一抗作陰性對照，已知陽性片作陽性對照。（2）逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應（RT－PCR）法：Ezrin、β內(nèi)參引物由上海生工生物工程技術服務有限公司設計合成。Trizol Reagent（Invitrogen）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Marker、DEPC（Sigma）、瓊脂糖、TBE等購自合肥志宏生物技術有限公司。①總RNA提取：?。?0℃冰箱內(nèi)存放的新鮮組織50μg，加Trizol研磨并按試劑盒說明操作，提取總RNA。用紫外分光光度儀 A260／A280檢測部分總 RNA，測得 OD260／OD280比值在1．8－2．0之間者，－80℃冰箱存儲備用。②逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：嚴格按照說明書的操作步驟進行操作，反應產(chǎn)物最終體積為20μl。③聚合酶鏈反應（PCR）：Ezrin基因上游引物5′－AAG GAG AGA AAC CGT GGA GAG－3′，下游引物5′－GTG CTG CCA CTC TTC AAC TTC－3′。β－actin上游引物5′－CTGGGACGACATGGAGAAAA－3′，下 游 引 物5′－AAGGAAGGCTGGAAGAGCGC－3′。 反 應 條件：95℃5min，94℃45s變性，Ezrin退火溫度57．7℃，β－actin退火溫度為55．6℃，各進行45s，72℃延伸45s，反應35個循環(huán)，最后一輪延伸7min。預期Ezrin擴增產(chǎn)物大小為358bp，β－actin擴增產(chǎn)物大小為564bp。

2．3結果判定 （1）免疫組化：Ezrin蛋白在胞質(zhì)內(nèi)表達，呈棕黃色顆粒。以1000個腫瘤細胞計數(shù)，陽性細胞數(shù)＜5%為（－），5%～25%為（＋），＞25%～50%為（＋＋），＞50%為（＋＋＋）［6］。（2）RTPCR：配制2%瓊脂糖凝膠放入電泳槽中，加入500ml×TBE。加樣：Mark5μl加入一孔中，PCR產(chǎn)物5μl＋0．25%溴化乙錠（EB）1μl混勻后另外孔內(nèi)，接好電源，電泳（電壓按100V，電流60mA）30min。結果在GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)中拍攝記錄，并使用圖像分析軟件行灰度掃描作半定量分析。

2．4統(tǒng)計學方法 應用SPSS17．0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計數(shù)等級資料采用獨立樣本t檢驗、卡方檢驗和Spearman秩相關檢驗，以α＝0．05為差異有統(tǒng)計學意義的界值。

結 果

1．Hp－L型檢測結果

（1）觀察革蘭染色切片發(fā)現(xiàn)，L型主要分布在胃癌癌巢、癌細胞胞漿、腺腔及間質(zhì)巨嗜細胞的胞質(zhì)內(nèi)。癌巢的壞死處幾乎無L型，正常組織內(nèi)少見。形態(tài)呈多形性，有巨形體、圓球體、原生小體等。多粘附于癌細胞及胃粘膜上皮細胞表面（圖1）。胃癌組中有64例革蘭染色檢出L型，僅10例同時檢出L型和Hp，檢出率分別為80．00%（64／80）、12．50%（10／80）；免疫組化 Hp－L型抗原表達陽性率為81．30%（65／80，圖2）；與革蘭染色L型檢出的陽性率具有一致性（P＞0．05）；80例胃癌組織中 Hp－L型陽性（即革蘭染色L型檢出陽性和免疫組化Hp－L型抗原表達同時陽性）的病例數(shù)為56例，其陽性率為70．00%；對照組中有9例革蘭染色同時檢出Hp和L型，免疫組化Hp－L型抗原表達陽性為16例，兩種方法檢測同時陽性（即 Hp－L型陽性）的有9例，陽性率為22．50%（9／40），Hp檢出陽性率為22．50%（9／40），經(jīng)統(tǒng)計學處理兩種方法Hp－L型檢出率無統(tǒng)計學意義（P＞0．05，表1）。

胃癌組與對照組Hp－L型感染陽性率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05，表2）。

表1 兩種方法Hp－L檢查結果比較Table 1 Two methods of Hp －L inspection result comparison

表2 不同組織中Hp－L檢測情況Table 2 The result of Hp－L detected in different gastric tissues

（2）比較Hp－L型感染陽性率與胃癌臨床病理因素的關系發(fā)現(xiàn)，Hp－L型感染陽性率僅與淋巴結轉(zhuǎn)移有關（P＜0．05），與胃癌細胞的分化程度、浸潤深度、腫瘤的臨床分期、患者的年齡和性別均無關（P＞0．05，表3）。

表3 胃癌中Hp－L型感染與臨床病理因素的關系Table 3 The relationship of Hp－L infection and clinical pathologic factors in gastric carcinom

2．胃癌組織中Ezrin蛋白及其mRNA的表達及意義

（1）免疫組化結果：從表4可見胃癌組織中Ezrin蛋白的表達陽性率為66．25%，對照組為26．00%，經(jīng)卡方檢驗，Ezrin蛋白在胃癌組和對照組的陽性表達率差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。

表4 不同組織中Ezrin蛋白表達情況Table 4 The expression of Ezrin protein in different tissues

Ezrin在組織中表達情況如圖3、4。

比較Ezrin蛋白表達陽性率與胃癌臨床病理因素的關系發(fā)現(xiàn)，Ezrin蛋白表達陽性率與胃癌細胞的分化程度、浸潤深度及淋巴結轉(zhuǎn)移有關（P＜0．05），而與腫瘤的臨床分期、患者的年齡和性別無關（P＞0．05）。

（2）RT－PCR 結果：用β－actin內(nèi)參（564bp處）和DNA標準分子量標記物（DNA Marker）作為參照和標尺，在凝膠成像儀下觀察可見，胃癌組和對照組中均有擴增的Ezrin條帶（358bp處），不同的是，胃癌組的條帶亮度較對照組高（圖5）。對30例胃癌患者的Ezrin／β－actin電泳條帶吸光度比值進行統(tǒng)計學分析，由表6可見，胃癌組中Ezrin mRNA的表達明顯高于對照組，二者差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。

表5 胃癌中Ezrin表達與臨床病理因素的關系Table 5 The relationship between Ezrin expression and clinical pathologic factors in gastric cancer

表6 Ezrin mRNA在胃癌組及對照組中的表達Table 6 The expression of Ezrin mRNA in gastric carcinoma and normal controls

3．胃癌的Hp－L型感染與Ezrin蛋白表達的關系

從表7可見胃癌組Hp－L型陽性組的Ezrin表達陽性率高于其陰性者，經(jīng)Spearman等級相關分析發(fā)現(xiàn)，胃癌組Ezrin陽性表達與Hp－L型陽性感染具有正相關性（r＝0．456，P＜0．05）。

表7 胃癌組Ezrin蛋白表達與Hp－L型感染的關系Table 7 The relations of Ezrin protein expression and Hp －L infection in gastric cancer group

討 論

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學特性。腫瘤細胞在轉(zhuǎn)移過程中存在細胞骨架及細胞黏附分子的改變，從而使腫瘤細胞擺脫細胞間黏附作用的控制，脫離原發(fā)灶而發(fā)生轉(zhuǎn)移［7］。Ezrin通過與細胞粘附分子的相互作用，調(diào)節(jié)細胞－細胞和細胞－細胞外基質(zhì)的黏附，參與腫瘤信號轉(zhuǎn)導途徑和腫瘤吞噬等機制，影響腫瘤轉(zhuǎn)移［8－10］。Ezrin分子的 C端與 N端能夠發(fā)生分子內(nèi)的相互作用，進行自身分子內(nèi)交聯(lián)，產(chǎn)生一個頭尾相連的閉合靜止構象。這種構象使得Ezrin與膜蛋白及肌動蛋白的結合位點被掩蓋起來，不能發(fā)揮其作用而維持在失活狀態(tài)。Ezrin可以通過一系列活化信號解除這種抑制機制而達到活化狀態(tài)［8］?；罨腅zrin的C－末端與細胞骨架的肌動蛋白相連，N末端則可通過與細胞表面的粘附分子cadherin、CD44等連接，調(diào)節(jié)細胞－細胞及細胞－細胞外基質(zhì)之間的黏附，從而影響腫瘤細胞的侵襲性等生物學行為［12］。本研究顯示Ezrin在正常胃組織中呈低表達（26%，13／40），而在胃癌組織中呈高表達（66．25%，53／80），兩者差異有統(tǒng)計學意義；且與淋巴結轉(zhuǎn)移、浸潤深度、胃癌分化程度有關，提示，胃癌組織中Ezrin蛋白的表達可促進胃癌的浸潤轉(zhuǎn)移。

1994年國際癌癥研究中心將Hp定為人類胃癌第一致癌物［13］。Hp陽性患者胃癌的發(fā)生率是Hp陰性患者的2．8－6倍［14，15］。隨著人們對 Hp研究的深入，發(fā)現(xiàn)Hp在不利于其生長繁殖的環(huán)境中易發(fā)生細胞壁的缺失而形成Hp－L型。Hp－L型對環(huán)境抵抗力強，對抗生素等具有較強的抵抗力［16－17］，是Hp適應外界不良條件的一種自我保護形式。本實驗通過對胃癌組織中Hp－L感染的檢測，結果顯示胃癌組中Hp－L型感染陽性率明顯高于對照組，兩者有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），證實 Hp－L型感染與胃癌的發(fā)生密切相關。此外Hp－L型感染還與胃癌的淋巴結轉(zhuǎn)移有關（P＜0．05），表明 Hp－L型感染可能還參與了胃癌的轉(zhuǎn)移過程。本實驗顯示胃癌組Hp－L型陽性組的Ezrin表達陽性率高于其陰性者，經(jīng)Spearman等級相關分析發(fā)現(xiàn)，胃癌組Ezrin陽性表達與 Hp－L型陽性感染具有正相關性（r＝0．456，P＜0．05），其機制可能為 Hp－L型導致慢性炎癥，然后釋放腫瘤壞死因子－α在內(nèi)的各種炎癥介質(zhì)，而腫瘤壞死因子－α又可以激活 Ezrin蛋白［18］，故 Hp－L型感染時可能導致Ezrin的表達上調(diào)，二者協(xié)同促進腫瘤細胞的遠處轉(zhuǎn)移。

綜上所述，Ezrin與Hp－L型呈正相關性，并在胃癌的浸潤轉(zhuǎn)移中起了重要的作用。

圖 版 說 明

圖1 胃腺癌中的L型 （革蘭染色×1000）

圖2 Hp－L型抗原在胃腺癌中的陽性表達（Elivision×400）

圖3 Ezrin蛋白在胃癌組織中表達陽性 （Elivision×400）

圖4 Ezrin蛋白在正常組織中表達陰性 （Elivision×400）

圖5 3例胃癌組織和癌旁正常組織中Ezrin mRNA的表達

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1L－form in gastric adenocarcinoma（Gram stain×1000）

Fig．2Positive expression of Helicobacter pylori L－form in gastric adenocarcinoma Elivision×400

Fig．3Positive expression of Ezrin protein in adenocarcinoma cancerous tissue（Elivision×400）

Fig．4negative expression of Ezrin protein in normal gastric mucosa tissues（Elivision×400）

Fig．5The expression of Ezrin mRNA in 3cases of gastric cancer tissues

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