陳江帆 姜海嬌 王秀茹 方長(zhǎng)清 李建華

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科暨中國(guó)醫(yī)科大學(xué)病理教研室，沈陽(yáng)110001）

缺氧在腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中很常見，最近研究表明HIF－1在缺氧刺激腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中具有重要作用。生化分析表明HIF－1是一類由α亞基和β亞基組成的異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子。HIF－1α是HIF－1的氧調(diào)節(jié)亞基，氧主要通過(guò)該亞基來(lái)調(diào)節(jié)HIF－1的生物活性。HIF－1β對(duì)氧的依賴性弱，但對(duì) HIF－1是不可缺少的，只有兩個(gè)亞基聚合形成共聚二聚體時(shí)才能形成有活性的 HIF－1［1］。本研究的目的是檢測(cè)HIF－1的兩種亞型 HIF－1α和 HIF－1β在非小細(xì)胞肺癌胸水細(xì)胞中的表達(dá)，并分析它們之間的關(guān)系，探討HIF－1在肺非小細(xì)胞癌胸水缺氧適應(yīng)性調(diào)節(jié)中的作用。

材料和方法

1．臨床資料

收集中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診及病房患者胸腔積液標(biāo)本1060例，肺穿刺組織活檢標(biāo)本120例，其中男性患者720例，女性患者460例：年齡小于等于50歲者390例，大于40歲者790例，所有胸腔積液標(biāo)本全部經(jīng)臨床、CT、磁共振及組織病理學(xué)確診。

2．試劑

鼠抗人 HIF－1α（SC－53546）單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa公司，鼠抗人 HIF－1β（ab54786）單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)abcam公司。CD34、VEGF鼠抗人單克隆抗體，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，S－P超敏免疫組化試劑盒和DAB酶底物顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

3．切片的制備

收集的1060例胸腔積液標(biāo)本采用液基細(xì)胞薄層方法（HOLOGIC TCT）常規(guī)制片、診斷后，經(jīng)95%乙醇固定后石蠟包埋、切片。每份標(biāo)本切片分別用做 HIF－1α、HIF－1β、CD34、VEGF免疫細(xì)胞化學(xué)染色。

4．實(shí)驗(yàn)方法

4．1液基細(xì)胞薄層檢測(cè)技術(shù)（HOLOGIC TCT

取50ml胸腔積液2000r／min離心5min后，棄上清液，加入50ml新柏氏細(xì)胞清洗液振蕩10－15min后2000r／min離心5min，棄上清吸取適量沉淀物加入新柏氏細(xì)胞保存瓶，靜置10min左右，用新柏氏液基細(xì)胞儀制成薄層細(xì)胞涂片，95%的酒精固定10min后巴氏染色。

4．2細(xì)胞塊制備方法

將存放十小時(shí)以上經(jīng)HOLOGIC TCT篩查結(jié)果為可疑瘤細(xì)胞或查到瘤細(xì)胞的剩余胸腔積液標(biāo)本2000r／min離心5min后，棄掉上清液，加入95%乙醇混勻后2000r／min離心5min固定2h以上后脫水石蠟包埋。

4．3免疫細(xì)胞及其免疫組織化學(xué)技術(shù)

1．NSCLC胸水中 HOLOGIC TCT和血管生成標(biāo)記物免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果

我們首先通過(guò)液基薄層細(xì)胞涂片（HOLOGIC TCT）篩查，篩選出胸腔積液中有可疑瘤細(xì)胞及查到瘤細(xì)胞的標(biāo)本病例做石蠟細(xì)胞包埋切片，并進(jìn)一步做HE和免疫細(xì)胞化學(xué)染色（如圖1ABC所示）。

2．NSCLC胸水標(biāo)本和NSCLC穿刺組織切片中 HIF－1α 和 HIF－1β 免 疫 組 化 染 色 結(jié) 果 （如 圖1DEFGH所示）。

3HIF－1α在NSCLC穿刺組織和胸水標(biāo)本內(nèi)的陽(yáng)性表達(dá)率分別為72．50%、17．55%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；HIF－1β在 NSCLC穿刺組織和胸水標(biāo)本內(nèi)的陽(yáng)性表達(dá)率分別為77．50%、81．42%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。（如表1所示）

常規(guī)石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，采用鏈霉素抗生物素蛋白－過(guò)氧化物酶法（streptavidin－peroxidase，S－P）進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色：切片常規(guī)烤片，脫蠟，水化：0．01mol／L檸檬酸鹽緩沖液高溫高壓抗原修復(fù)20min；內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷溶液37℃下孵育30min；非免疫性動(dòng)物血清37℃下孵育40min；一 抗 4℃ 下 孵 育 過(guò) 夜，HIF－1α、HIF－1β、CD34、VEGF稀釋比例為1∶100．生物素標(biāo)記的二抗37℃下孵育30min；鏈霉素親和素過(guò)氧化物酶溶液37℃下孵育30min；新配置的DAB溶液顯色；蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。各步之間用PBS（PH＝7．4）沖洗三次，每次5min。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性肺癌切片作陽(yáng)性對(duì)照。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，每張切片在光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)瘤細(xì)胞，著色強(qiáng)度分為無(wú)色為0分，淺黃色或黃色為1分，棕黃色為2分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分為＜10%為0分，10%－50%為1分，＞50%為2分，兩項(xiàng)得分相乘結(jié)果＞2記為陽(yáng)性（＋），＜2為陰性。

5．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，多組數(shù)據(jù)的陽(yáng)性率比較采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Sperman等級(jí)相關(guān)分析判別HIF－1α與HIF－1β表達(dá)的相關(guān)性，HIF－1α與VEGF表達(dá)的相關(guān)性，HIF－1β與VEGF表達(dá)的相關(guān)性。

結(jié) 果

表1 1180例非小細(xì)胞肺癌中免疫細(xì)胞化學(xué)指標(biāo)的表達(dá)Table 1 The expression of Immunocytochemistry in 1180cases non－small cell lung cancer

4．NSCLC胸水中HIF－1和VEGF的相關(guān)性分析：HIF－1α與 HIF－1β的表達(dá)呈正相關(guān)（見表2），HIF－1α與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)（見表3），HIF－1β與VEGF的表達(dá)無(wú)相關(guān)性（見表4）。

表3 NSCLC胸水中HIF－1α表達(dá)與VEGF的相關(guān)性Table 3 The relationship between HIF－1αand VEGFexpressions in non－small cell lung cancer pleural effusion cells

表4 NSCLC胸水中HIF－1β表達(dá)與VEGF的相關(guān)性Table 4 The relationship between HIF－1β and VEGF expressions in non－small cell lung cancer pleural effusion cells

討 論

NSCLC是呼吸系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，惡性腫瘤在生長(zhǎng)過(guò)程中，由于組織生長(zhǎng)過(guò)快會(huì)造成局部嚴(yán)重缺氧。HIF－1是由semenza等于1992年在缺氧誘導(dǎo)的肝細(xì)胞癌細(xì)胞株Hep3B細(xì)胞核提取物中發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄因子，由120kD的α亞單位（HIF－1α）與91～94kD的β亞單位（HIF－1β）組成［2］。HIF－1α只在缺氧細(xì)胞核中表達(dá)，與多種腫瘤發(fā)展密切相關(guān)，HIF－1β為 HIF－1的輔助調(diào)節(jié)亞基，國(guó)內(nèi)針對(duì) HIF－1β研究報(bào)道較少［3］。Marxsne等［4］對(duì)皮膚癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌等分別作了分析，發(fā)現(xiàn)在這些癌組織中HIF－1α過(guò)表達(dá)，且在腫瘤壞死明顯的區(qū)域和腫瘤浸潤(rùn)的邊緣，HIF－1α表達(dá)明顯增多，而在腫瘤組織內(nèi)的基質(zhì)細(xì)胞和鄰近的正常組織則未見HIF－1α 的 表 達(dá)。 本 研 究 結(jié) 果 表 明，HIF－1α 在NSCLC胸水標(biāo)本和穿刺組織中陽(yáng)性表達(dá)率具有明顯差異，這可能與惡性胸水腫瘤細(xì)胞數(shù)量以及所處的缺氧微環(huán)境與腫瘤組織之間的差異有關(guān)。

實(shí)體瘤的進(jìn)行性生長(zhǎng)依賴于其誘導(dǎo)產(chǎn)生的血管網(wǎng)的建立。許多直接、間接的證據(jù)已經(jīng)證明，腫瘤生長(zhǎng)是依賴血管的［5－6］。血管形成確保了腫瘤代謝的進(jìn)行，對(duì)腫瘤增殖必不可少。本研究表明，離體NSCLC胸水腫瘤細(xì)胞在缺少氧氣和營(yíng)養(yǎng)的條件下，可以分化為腫瘤細(xì)胞血管樣結(jié)構(gòu)，由于惡性胸水脫落細(xì)胞中只存在上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，無(wú)內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)CD34和VEGF免疫細(xì)胞化學(xué)染色證實(shí)了在NSCLC胸水中存在著腫瘤血管生成。通過(guò)相關(guān)性分析證實(shí) HIF－1α和 HIF－1β、VEGF表達(dá)之間均存在一定的正相關(guān)關(guān)系，目前研究表明，在缺氧調(diào)節(jié)信號(hào)通路中，VEGF為HIF－1和腫瘤血管生成之間的重要樞紐。腫瘤細(xì)胞快速生長(zhǎng)所造成的缺氧環(huán)境可誘導(dǎo)HIF－1α的表達(dá)，而HIF－1α又可調(diào)節(jié)其下游基因VEGF的表達(dá)而促進(jìn)血管形成和腫瘤的生長(zhǎng)［7－8］。

總之，HIF－1與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)等過(guò)程密切相關(guān)。HIF－1α可能是調(diào)控與腫瘤血管生長(zhǎng)密切相關(guān)基因的上游基因，因此對(duì)HIF－1的研究和調(diào)控在抑制腫瘤組織生長(zhǎng)及其血管形成方面具有廣闊的前景和價(jià)值，勢(shì)必將成為今后抗腫瘤治療的新靶點(diǎn)。而HIF－1α和VEGF的相互影響和促進(jìn)的關(guān)系，為今后使用VEGF抑制劑協(xié)同治療腫瘤提供了有力的依據(jù)。

圖 版 說(shuō) 明

圖1A 胸水中非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞HE染色×400；

圖1B CD34在非小細(xì)胞肺癌胸水細(xì)胞質(zhì)中陽(yáng)性表達(dá)（S－P）×400；

圖1C VEGF在非小細(xì)胞肺癌胸水細(xì)胞質(zhì)中陽(yáng)性表達(dá)（SP）×400；

圖1D HIF－1α在非小細(xì)胞肺癌胸水細(xì)胞核中陽(yáng)性表達(dá)（SP）×400；

圖1E HIF－1β在非小細(xì)胞肺癌胸水細(xì)胞質(zhì)中陽(yáng)性表達(dá)（SP）×400；

圖1F 非小細(xì)胞肺癌穿刺組織HE染色×400；

圖1G HIF－1α在非小細(xì)胞肺癌穿刺組織中陽(yáng)性表達(dá)（S－P）×400；

圖1H HIF－1β在非小細(xì)胞肺癌穿刺組織中陽(yáng)性表達(dá)（S－P）×400；

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1ANon－small cell lung cancer cells of pleural effusion（HE）×400；

Fig．1BCD34positive expression in the cytoplasm of nonsmall cell lung cancer pleural effusion（S－P）×400；

Fig．1CVEGF positive expression in the cytoplasm of nonsmall cell lung cancer pleural effusion（S－P）×400；

Fig．1DHIF－1αpositive expression in the nucleus of nonsmall cell lung cancer pleural effusion（S－P）×400；

Fig．1EHIF－1βpositive expression in the cytoplasm of nonsmall cell lung cancer pleural effusion（S－P）×400；

Fig．1FNon－small cell lung cancer puncture organizations（HE）×400；

Fig．1GHIF－1αpositive expression in non－small cell lung cancer puncture organizations（S－P）×400；

Fig．1HHIF－1βpositive expression in non－small cell lung cancer puncture organizations（S－P）×400；

［1］S Torii，Y Goto，T Ishizawa，et al．Pro－apoptotic activity of inhibitory PAS domain protein（IPAS），a negative regulator of HIF－1，through binding to pro－survival Bcl－2 family proteins．Cell Death and Differentiation，2011，18：1711－1725

［2］Young－Gun Yoo，Jared Christensen and L Eric Huang．HIF－1aconfers aggressive malignant traits on human tumor cells independent of its cano－nical transcriptional function．Cancer Res．2011，71（4）：1244－1252

［3］Semenza GL．Signal transduction to hypoxia－inducible factor l．Biochemical pharmacology，2002，64：993－998

［4］Damert A，Machein M，Breierq et al．Up－regulation of vascular endothelial growth factor expression in a rat glioma is conferred by two distinct hypoxia driven mechanisms．Cancer Res，1997，57（17）：3860－3864

［5］Thaloor D，Singh A K，Sidhu G S，et al．Inhibition of angiogenic differentiation of human umbilical vein endothelial cells by cureumin．Cellgrowth differ，1998，9（4）：305－312

［6］PAPETTI M，HERMAN IM．Mechanisms of normal and tumor－derived angiogenesis．Am J Physiol Cell Physiol，2002，282：947－970

［7］Buchler P，Reber HA，Buchler M，et al．Hypoxia inducible factor－1regulates vascular endothelial growth factor expression in human pancreatic cancer．Pancres，2003，26（1）：56－64

［8］Martin J，Siemerink，Ingeborg Klaassen，et al．CD34marks angiogenic tip cells in human vascular endothelial cell cultures．Angiogenesis，2012，15：151－163