李 可，張 慶,*，陳 功，林 凱，袁春紅，賈碧洪，鐘小廷，向文良

（1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川省食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西華大學(xué)古法發(fā)酵（釀造）生物技術(shù)研究所，四川 成都610039；2.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，四川 成都 611130）

青菜腌制過程中腐敗表層細(xì)菌的多樣性分析與群落演替

李 可1，張 慶1,*，陳 功2，林 凱1，袁春紅1，賈碧洪1，鐘小廷1，向文良1

（1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川省食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西華大學(xué)古法發(fā)酵（釀造）生物技術(shù)研究所，四川 成都610039；2.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，四川 成都 611130）

通過構(gòu)建16S rRNA基因文庫揭示青菜腌制過程中腐敗表層細(xì)菌群落構(gòu)成，利用Shannon-Weaver（H）、Chao、ACE、Simpson、覆蓋度和相關(guān)性指數(shù)分析群落的多樣性及演替關(guān)系。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，從樣品中獲得的16S rRNA基因序列分別被歸為Vibrio、Halomonas、Pseudoalteromonas、Shewanella、Marinomonas、Geobacillus、Pseudomonas、Psychrobacter、Cobetia、Oceanobacillus、Pantoea和Lactobacillus屬。其中能夠產(chǎn)生亞硝酸鹽的致病性Vibrio屬細(xì)菌為腐敗表層鹵水中的優(yōu)勢菌，分別占腌制7、22、60 d細(xì)菌總數(shù)的45.8%、74.2%、44.9%，Pseudoalteromonas、Shewanella、Pseudomonas等屬腐敗性細(xì)菌主要分布在第7天的樣品中，受高鹽環(huán)境的影響，Cobetia、Halomonas等嗜鹽菌和Lactobacillus屬細(xì)菌的數(shù)量隨時(shí)間的延長逐漸增多。7、22、60 d樣品菌群相關(guān)性系數(shù)由0.5131降至0.4064，隨之又升高至0.8168。結(jié)果表明：腐敗表層鹵水中細(xì)菌在青菜腌制過程中介導(dǎo)腐敗并產(chǎn)生有害成分，其群落結(jié)構(gòu)隨腌制過程演替。

青菜腌制；鹽鹵；細(xì)菌多樣性；16S rRNA；群落演替

蔬菜的腌制是中華民族對世界食品發(fā)展的特殊貢獻(xiàn)之一，并在人類文明發(fā)展歷程中成為全球最普遍和大眾化的蔬菜貯藏和加工方式。蔬菜腌制主要以各種蔬菜為原料，同時(shí)添加食鹽、蔥、姜、蒜、香辛料等多種成分，借助于蔬菜表面附著的微生物在鹽鹵中發(fā)酵而成[1]。在發(fā)酵過程中，不同微生物以蔬菜為營養(yǎng)基質(zhì)，借助其生長與代謝特性的差異，通過競爭、協(xié)同等作用調(diào)節(jié)蔬菜腌制過程中微生物的種類和數(shù)量消長，從而形成腌制蔬菜特殊的風(fēng)味[2-3]。但是，在腌制過程中往往由于酵池封閉不嚴(yán)、操作不當(dāng)和生產(chǎn)環(huán)境因素等的影響，會(huì)造成表層腌制蔬菜中大量的腐敗 微生物滋生。這些腐敗微生物的存在打破了蔬菜腌制系統(tǒng)中原有的微生物生態(tài)平衡，不僅改變了腌制蔬菜的特有風(fēng)味，而且存在極大的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。

腐敗微生物引起的腌制蔬菜腐敗是蔬菜腌制過程中最主要的腐敗原因。目前，對于蔬菜制品腐敗微生物的研究，多見于對1種腐敗微生物腐敗特性或食品中腐敗微生物控制方法上的研究[4-5]，而鮮有文獻(xiàn)對腐敗食品中微生物種類及菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。四川泡菜是中國泡菜的典型代表，在四川泡菜生產(chǎn)的腌制環(huán)節(jié)中每年由于腐敗微生物引起的蔬菜腐敗約占泡菜加工量的5%～7%，直接經(jīng)濟(jì)損失8～10億元人民幣[6]。然而，目前還未見有關(guān)四川泡菜腌制過程中腐敗微生物的相關(guān)報(bào)道。

基于此，本研究主要以四川泡菜生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的腌制青菜為對象，直接從腌制青菜腐敗表層的鹽鹵中提取總DNA，利用16S rRNA基因文庫分析技術(shù)解析青菜腌制過程中表層腐敗細(xì)菌的多樣性，同時(shí)利用Baroni-Urbani相關(guān)性系數(shù)探尋這些細(xì)菌伴隨腌制過程而發(fā)生的群落演替關(guān)系，為下一步探尋合理、有效控制四川泡菜生產(chǎn)環(huán)節(jié)中青菜腌制腐敗的措施提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)樣品為四川某泡菜公司青菜腌制池上層腌制7 d（P1）、22d（P2）和60 d（P3）的含7 g/100 mL NaCl的鹽鹵。

A.E.Z.N.A.TMSoil DNA Kit Plasmid Mini Kit Ⅰ 美國Omega公司；pGEM-T Easy Vector System Ⅰ 美國Promega公司；Taq DNA聚合酶 日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 鹽鹵樣品總DNA提取及16S rRNA基因PCR擴(kuò)增

樣品采集后立即按照A.E.Z.N.A.TM Soil DNA Kit進(jìn)行總DNA的提取，提取的總DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，PCR擴(kuò)增細(xì)菌的16S rRNA 基因。PCR體系：30 μL ddH2O，5 μL 10×PCR Reaction Buffer（無Mg2+），6 μL MgCl2（25 mmol/L），4 μL dNTP（2.5 mmol/L），引物Eu27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）、1 490 R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）各1 μL，1 μL Taq聚合酶（2.5 U/μL），2 μL總DNA模板。PCR程序參考Xiang Wenliang等[7]的方法，簡述如下：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃保持10 min。

1.2.2 16S rRNA 基因克隆文庫構(gòu)建

按照pGEM-T Easy Vector System I說明將PCR產(chǎn)物連接至pGEM-T載體，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α中，涂布于含Amp（100 μg/mL）、IPTG（24 μg/mL）和X-gal（40 μg/mL）的LB培養(yǎng)基平板上，篩選陽性克隆子。

1.2.3 16S rRNA測序及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

挑取陽性克隆子，按照Plasmid Mini Kit I說明提取重組質(zhì)粒，經(jīng)EcoR I酶切檢測后含有完整16S rRNA的重組質(zhì)粒采用Applied Biosystems DNA Sequencer（model 377）自動(dòng)測序。測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫NCBI BLAST比對后，再通過Clustal X1.8軟件將代表序列與數(shù)據(jù)庫中所得序列進(jìn)行完全比對，利用MEGA5.0軟件Neighbor-Joining法進(jìn)行1 000次步長計(jì)算構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。代表序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得序列號：KC502871～KC502885。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析及基因文庫評估

獲得的序列用CLASSIFIER（RDPII，http://rdp.cme. msu.edu./classifier/classifier.jsp）進(jìn)行分類，利用BioEdit軟件對所有序列進(jìn)行兩兩比對，同源性大于97%的歸為同一個(gè)操作分類單元（OTU）。根據(jù)所得OTU個(gè)數(shù)以及每個(gè)OTU樣本豐富度，利用Rarefaction 1.3軟件進(jìn)行分析并繪制稀釋度曲線。采用Estimates Win 8.0計(jì)算Shannon-Weaver、Sobs、SChao1、SACE等多樣性指數(shù)以及Simpson優(yōu)勢度指數(shù)分析比較細(xì)菌物種的多樣性，利用下式計(jì)算文庫覆蓋度指數(shù)；利用DPS v7.05軟件計(jì)算不同腌制時(shí)期腐敗細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)的Baroni-Urbani相關(guān)性系數(shù)，探尋微生物菌群伴隨腌制過程而表現(xiàn)的演替關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 青菜腌制腐敗表層鹽鹵中微生物的多樣性

圖1 基于OTU豐富度及OTU分類個(gè)數(shù)的16S rRNNAA基因文庫稀釋度曲線分析Fig.1 The rarefaction analysis of 16S rRNA clone libraries based on abundance and classification number of OTU

稀釋度曲線是一種有效的形態(tài)學(xué)和分類多樣性分析方法[8]，在本研究中，稀釋度曲線分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)樣品中OTU數(shù)目隨著16S rRNA克隆子數(shù)的增加而增加，并趨于平緩，如圖1所示。這表明本研究中構(gòu)建的3個(gè)16S rRNA文庫已趨于飽和，所獲得的克隆子代表的微生物種類和數(shù)量能夠比較全面和真實(shí)地表征樣品細(xì)菌群落，體現(xiàn)群落的結(jié)構(gòu)類型、組織水平和發(fā)展階段。此外，細(xì)菌的多樣性分析結(jié)果進(jìn)一步證明以上結(jié)論，其中，青菜腌制7、22、60 d的腐敗表層v中細(xì)菌的豐富度指數(shù)SACE和SChao1分別為10.5和10、6和6、10.5和10，覆蓋度分別為97.6%、100%和97.6%（表1）。3個(gè)樣品中的多樣性指數(shù)分別為1.98、1.25和2.02，Simpson優(yōu)勢度指數(shù)分別為6.26、2.48和7.02。以上結(jié)果表明，該方法所檢測的微生物結(jié)構(gòu)菌群能夠表征青菜腌制池中97.6%到100%的腐敗微生物種類及數(shù)量。

表1 青菜不同發(fā)酵時(shí)期鹽鹵樣品中OTU豐富度和多樣性評估Table 1 The abundance and diversity estimation of OTU derived from brine samples during different fermentation periods

2.2 青菜腌制腐敗表層微生物的分布

圖2 不同發(fā)酵時(shí)期鹽鹵樣品中各種細(xì)菌分布Fig.2 Bacterial distribution in three samples during different periods of pickled leaf mustard

將所測得的序列提交至RDP進(jìn)行分類。該214個(gè)克隆子分別歸于Vibrio、Halomonas、Pseudoalteromonas、Shewanella、Marinomonas、Geobacillus、Pseudomonas、Psychrobacter、Cobetia、Oceanobacillus、Pantoea和Lactobacillus。其中Vibrio（38/83）和Psychrobacter（13/83）為P1期的優(yōu)勢菌群，Vibrio（46/62）為P2期的優(yōu)勢菌群，Vibrio（31/69）、Cobetia（11/69）和Lactobacillus（10/69）為P3時(shí)期的優(yōu)勢群，具體細(xì)菌分布情況如圖2所示。根據(jù)以上3個(gè)樣品所得序列構(gòu)建克隆文庫，分別從發(fā)酵7、22、60 d樣品中得到83、62、69個(gè)克隆子，再分別將各文庫中序列的同源性＞97%的聚成一個(gè)OTU，3個(gè)文庫分別獲得10、6和10個(gè)OTU，大部分OTU均含有多個(gè)克隆子，僅少數(shù)OTU僅含有一個(gè)克隆子。

2.3 青菜腌制腐敗表層微生物的系統(tǒng)發(fā)育

圖3 基于16S rRNA構(gòu)建的青菜不同發(fā)酵時(shí)期鹽鹵中細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of bacteria in brine samples during different fermentation periods based on 16S rRNA sequence

Devereux等[9]認(rèn)為當(dāng)16S rRNA的序列同源性≥97%時(shí)可以認(rèn)為是一個(gè)屬，同源性≥98%時(shí)則可以認(rèn)為是同一個(gè)種。為了進(jìn)一步探明青菜腌制腐敗表層鹵水中微生物的系統(tǒng)發(fā)育地位及進(jìn)化信息，選取每個(gè)OTU的代表序列與GenBank中菌株的16S rRNA序列進(jìn)行全序列比對，找到相近序列后，利用Neighbor-Joining方法計(jì)算各16S rRNA序列之間的親緣關(guān)系，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示。除代表序列P1-19外，各OTU代表序列都與NCBI數(shù)據(jù)庫中典型菌株16S rRNA序列同源性在98%以上，分別與Vibrionales目的Vibrio azureus、Vibrio parahaemolyticus、Vibrio litoralis；Bacillales目的Oceanobacillus sojae和Geobacillus gargensis；Lactobacillales目的Lactobacillus sakei；Enterobacteriales目的Pantoea ananatis；Alteromonadales目的Pseudoalteromonas mariniglutinosa和Shewanella morhuae；Pseudomonadales目的Pseudomonas fluorescens和Psychrobacter glacincola；Oceanospirillales目的Marinomonas arenicola、Cobetia marina和Halomonas halodenitrifi cans聚為一枝。P1-19與NCBI數(shù)據(jù)庫中典型菌株Vibrio penaeicida序列同源性為97%，在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為一簇，說明它們在進(jìn)化上同源性較高，但有可能是潛在的新種，具體分類有待進(jìn)一步研究。

2.4 青菜腌制腐敗表層中微生物群落的演替

微生物群落的演替是存在于各種環(huán)境的一種常見現(xiàn)象，由于微生物具有較短的代時(shí)且其對環(huán)境變化較為敏感，在蔬菜腌制過程中，微生物群落結(jié)構(gòu)的變化能夠及時(shí)反應(yīng)環(huán)境的變化，并且決定環(huán)境及產(chǎn)品的特性。因此，可以通過了解微生物種群之間的演替關(guān)系評估和判斷腌制過程。由表2可知，在青菜腌制過程中，隨著腌制時(shí)間的延長，3個(gè)時(shí)期微生物相關(guān)性系數(shù)由0.513 1降低至0.406 4，隨之又升高至0.816 8。結(jié)果表明，微生物群落結(jié)構(gòu)隨著青菜腌制過程的變化而發(fā)生變化，微生物的種類和數(shù)量與青菜的腐敗過程存在著一定的相關(guān)性。

表2 青菜不同發(fā)酵時(shí)期鹽鹵樣品中細(xì)菌群落Baroni-Urbani & Buser相似性系數(shù)Table 2 Similarity coefficient of Baroni-Urbani and Buser based on the bacterial community of three brine samples

3 討 論

蔬菜腌制是全球最普遍和大眾化的食品加工和貯藏方式之一，腌制的蔬菜以其爽滑脆嫩的品質(zhì)廣受消費(fèi)者的歡迎。然而，隨著人們對食品安全越來越重視，食品腐敗尤其是由微生物引起的食品腐敗成為食品行業(yè)的一個(gè)亟待解決的重要問題[4]。目前，國內(nèi)有關(guān)食品腐敗機(jī)制的研究多停留在對腐敗現(xiàn)象表面認(rèn)識的研究，而忽略了對蔬菜腌制過程中腐敗微生物的菌群結(jié)構(gòu)及演替這一關(guān)鍵因素的研究，因此，基于腐敗表象認(rèn)識基礎(chǔ)上進(jìn)行的防腐技術(shù)研究也表現(xiàn)出一定的局限性。本實(shí)驗(yàn)利用16S rRNA技術(shù)分析腐敗過程中微生物多樣性及其演替關(guān)系，結(jié)果顯示，在腌制青菜腐敗表層微生物主要為致病性微生物，常見于海水和海產(chǎn)品，且微生物菌群結(jié)構(gòu)與青菜腌制過程相關(guān)。本研究為從根本上認(rèn)識和解決青菜腌制過程中的微生物腐敗現(xiàn)象提供科學(xué)借鑒。

翁佩芳[10]、李文斌[11]等對泡菜中微生物的研究表明，泡菜中功能微生物菌群是由乳桿菌屬、明串珠菌屬、魏斯氏菌屬和希臘魏斯氏菌屬構(gòu)成，并且起主導(dǎo)作用的為植物乳桿菌。而在本實(shí)驗(yàn)青菜腌制過程中，腐敗表層鹵水中存在較多的為致病性的Vibrio屬。在前期，腐敗表層鹵水中微生物主要為Vibrio、Shewanella、Pseudomonas、Pantoea、Phyllobacterium、Oceanobacillus和Geobacillus屬細(xì)菌，這些細(xì)菌多數(shù)來源于青菜的表面和環(huán)境。V. penaeicida為該時(shí)期的優(yōu)勢菌，該菌是一種能夠引起河蝦弧菌病93綜合征的主要菌種之一[12-13]。同時(shí)被檢測到的Pseudoalteromonas、 Shewanella、Pseudomonas屬細(xì)菌能夠產(chǎn)生多種胞外酶，與具有淀粉水解能力的Vibrio屬細(xì)菌一起在降解蔬菜中的纖維素、果膠、淀粉、蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)方面發(fā)揮作用[5,14-16]，其中Pseudomonas和Shewanella也是腐敗海產(chǎn)品樣品中的主要菌[17]。這些菌在蔬菜腌制過程中能夠引起蔬菜質(zhì)構(gòu)發(fā)生變化，同時(shí)為腐敗中后期其他菌群的生長和繁殖提供條件，因此它們是引起蔬菜腐敗變質(zhì)的主要菌。

本實(shí)驗(yàn)青菜腌制至22 d，由于受到腌制環(huán)境因素的限制，嗜鹽菌和乳酸桿菌的數(shù)量有所上升，Pseudoalteromonas、Shewanella、Pseudomonas、Pantoea、Oceanobacillus 和 Geobacillus等屬細(xì)菌數(shù)量下降甚至低于檢測限，而V. penaeicida依然是優(yōu)勢菌，同時(shí)也檢測出前期未檢測到的V. parahaemolyticus。V. parahaemolyticus不僅能引起河蝦的弧菌病，還是一海水和海產(chǎn)品中常見的導(dǎo)致O3∶K6血清型流行病的致病菌，具有較強(qiáng)的致病能力及食源性傳染，尤其是在亞洲、北美等地，因此受到各國的重視[18-19]。此外，V. parahaemolyticus、V. penaeicida與腌制60 d檢測到得的V. litaralis均具有將鹵水中的NO3－還原為NO2－的能力，增加了泡菜中亞硝酸鹽的含量，因此Vibrio屬細(xì)菌的大量存在可能是導(dǎo)致腌制蔬菜中亞硝酸鹽含量超標(biāo)的主要原因之一。隨著腌制時(shí)間的延長，至腌制60 d，V. parahaemolyticus逐漸成為優(yōu)勢菌；同時(shí)乳酸菌L. sakei和嗜鹽菌C. marina、H. halodenitrificans的數(shù)量明顯增加。L. sakei是肉及海產(chǎn)品中常見的一種菌，由于其產(chǎn)酸、細(xì)菌素等特性在抑制腐敗、致病性微生物和增香等方面發(fā)揮作用，可以用作肉制品發(fā)酵用曲和用于食品保藏延長貨架期[20-21]，該菌可能在減少腌制過程中Vibrio屬和其他腐敗性微生物數(shù)量起到關(guān)鍵作用。嗜鹽菌C. marina和H. halodenitrificans數(shù)量增加與其腌制池中的高鹽環(huán)境的適應(yīng)性有關(guān)，但是其在蔬菜腐敗及蔬菜腌制過程中的作用有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)通過對青菜中腐敗微生物群落結(jié)構(gòu)的分析探明影響腌制青菜安全性的生物學(xué)因素，結(jié)果表明：青菜腌制過程中腐敗表層微生物主要為具有致病性和亞硝酸鹽產(chǎn)生能力的Vibrio屬及Pseudomonas、Shewanella、Pseudoalteromonas等屬腐敗性微生物，并且微生物群落結(jié)構(gòu)與腌制過程表現(xiàn)出相關(guān)性。該研究結(jié)果為控制青菜腌制過程中腐敗微生物的生長、提高食品質(zhì)量安全具有重要的意義。

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Diversity and Community Succession of Surface Spoilage Bacteria in Leaf Mustard during Pickling Process

LI Ke1, ZHANG Qing1,*, CHEN Gong2, LIN Kai1, YUAN Chun-hong1, JIA Bi-hong1, ZHONG Xiao-ting1, XIANG Wen-liang1
(1. Provincial Key Laboratory of Food Biotechnology of Sichuan, Institute of Ancient Brewing Technology, College of Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China; 2. Sichuan Academy of Food and Fermentation Industries, Chengdu 611130, China)

16S rRNA analysis was employed to investigate the microbial populations in putrefactive surface layer during leaf mustard pickling process. The microbial diversity and dynamics were assessed by Shannon-Weaver, Chao, ACE, Simpson, rarefaction analysis and similarity coefficient. All 16S rRNA gene sequences retrieved from brine samples with pickling for 7, 22 d and 60 d were assigned to Vibrio, Halomonas, Pseudoalteromonas, Shewanella, Marinomonas, Geobacillus, Pseudomonas, Psychrobacter, Cobetia, Oceanobacillus, Pantoea and Lactobacillus. Amo ng thes e genera, the dominant bacterium during the pickling process was pathogenic Vibrio and its number in these three samples was 45.8%, 74.2% and 44.9%, respectively. The spoilage bacteria such as Pseudoalteromonas, Shewanella and Pseudomonas were mainly observed on day 7, and the number of Lactobacillus, Cobetia and Halomonas was gradually increased with the pickling process. The community similarity coefficient was decreased to 0.4064 from 0.5131 and then increased to 0.8168. The results indicated that the bacterial succession was associated with the pickling process and such succession is responsible for the spoilage of leaf mustard and the production of some noxious ingredients. These results provide a useful guidance for quality and safety control of pickled leaf mustard.

leaf mustard pickling; brine; bacterial diversity; 16S rRNA; succession

TS201.3

A

1002-6630(2014)01-0180-05

10.7506/spkx1002-6630-201401035

2013-01-26

四川省泡菜產(chǎn)業(yè)鏈項(xiàng)目（2012NZ0002-8）；西華大學(xué)重點(diǎn)科研基金項(xiàng)目（Z1220531）；成都市自主創(chuàng)新一般項(xiàng)目（Z0102234）

李可（1987—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c微生態(tài)。E-mail：like2341@126.com

*通信作者：張慶（1979—），男，講師，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：biozhangq@163.com