王一然，賀 蘭，劉進(jìn)輝，徐 芳，劉湘新，賀建華*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.益陽(yáng)市赫山區(qū)滄水鋪人民醫(yī)院，湖南 益陽(yáng) 413064； 4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種由肝細(xì)胞脂肪變性發(fā)展到炎癥、肝纖維化的一組疾病。隨病程進(jìn)展表現(xiàn)不一，包括單純性脂肪肝（nonalcoholic simple fatty liver，NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、肝纖維化及其肝硬化和隱源性肝硬化3個(gè)階段[1]。其中N ASH降低了同患心血管疾病的NASH患者的存活率，升高了同患Ⅱ型糖尿病的NASH患者罹患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)[2]，NAFL和NASH是一個(gè)連續(xù)病變過程，如在NASH形成前積極干預(yù)，可預(yù)防NASH的形成及減少肝纖維化及其相關(guān)肝硬化的發(fā)生。

植物甾醇及其衍生物廣泛應(yīng)用于食品與美容行業(yè)，因其明顯的降脂降膽固醇作用，近年來更作為營(yíng)養(yǎng)添加劑得到人們關(guān)注[3-4]。大量研究結(jié)果顯示，植物甾醇具有預(yù)防和治療心血管疾病作用，而非酒精性脂肪性肝病是導(dǎo)致心血管疾病的危險(xiǎn)因素[5-6]。Xu Zuyuan等[7]研究發(fā)現(xiàn)apoE（-/-）小鼠在長(zhǎng)期的植物甾醇處理下，能改變apoE（-/-）小鼠肝臟的基因表達(dá)，其作用機(jī)制可能與植物甾醇抑制膽固醇的吸收有關(guān)。Calpe-Berdiel等[8]用全基因組測(cè)序和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法研究了植物甾醇對(duì)apoE（-/-）小鼠的小腸和肝臟的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有類型小鼠的腸膽固醇吸收都有降低，而血漿膽固醇的降低只發(fā)生于apoE（-/-）和LDLR（-/-）小鼠。Hirai等[9]用雌性大鼠研究了膳食脂肪和植物甾醇對(duì)血清脂肪酸成分和脂蛋白膽固醇的影響，結(jié)果顯示，添加5%植物甾醇到含10%黃油-膽固醇膳食里，減少了原有總膽固醇水平，升高了高密度脂蛋白與低密度脂蛋白+極低密度脂蛋白的比值。

米糠是稻谷加工的副產(chǎn)品，我國(guó)年產(chǎn)量約1000萬t，居世界之首，但比起發(fā)達(dá)國(guó)家，我國(guó)米糠的經(jīng)濟(jì)利用效率仍有一定差距。米糠油比大豆油含有更豐富的植物甾醇，主要成分為谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇[10-11]，米糠油提取的米糠植物甾醇具有眾多生物活性作用，糠甾醇片也是我國(guó)特殊的牙科用藥，可治療牙周炎等牙疾病，具有良好消炎功效。鑒于米糠的上述作用和特性，課題組認(rèn)為米糠甾醇（rice bran sterol，RBS）可能對(duì)非酒精性脂肪性肝炎大鼠具有干預(yù)治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

體質(zhì)量160～190g的健康成年雄性SD大鼠50只，購(gòu)自長(zhǎng)沙市開福區(qū)東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技服務(wù)部（編號(hào)HNACSDC20120324；許可證號(hào)SCXK（湘）2009-0012）。

米糠甾醇（純度：75%） 濟(jì)寧安康制藥有限責(zé)任公司。

造模用高脂飼料配方原料：基礎(chǔ)飼料78.9%、豬油10%、全脂奶粉5%、蛋黃粉5%、膽固醇1%、豬膽鹽0.1%。

基礎(chǔ)飼料 長(zhǎng)沙東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技服務(wù)部；豬油自制；全脂奶粉 伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司；蛋黃粉：50%自制，50%購(gòu)自吉林金翼蛋業(yè)有限責(zé)任公司；膽固醇（分析純）、豬膽鹽 北京索萊寶科技有限公司。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）試劑盒 南京建成生物工程研究所；甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）檢測(cè)試劑盒 深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）測(cè)試盒（自制）。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ2200DV超聲波儀 昆山市超聲儀器有限公司；Thermo1510酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；BS200全自動(dòng)生化分析儀 深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；5417R低溫高速離心機(jī) 美國(guó)Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組與處理

SD系雄性大鼠，隨機(jī)分成5組，每組10只：Ⅰ組為正常對(duì)照組，Ⅱ組為NASH模型組，Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組分別為RBS低、中、高劑量組（65、130、195mg/kg）。美國(guó)食品藥品監(jiān)督總局推薦人每天至少攝入1.3g植物甾醇酯（0.8g植物甾醇）[12]，實(shí)驗(yàn)組米糠甾醇低劑量根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)折算（0.8g/70kg×6）。適應(yīng)性飼喂7d后開始造模，Ⅰ組飼喂普通飼料，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組飼喂高脂飼料，于造模日開始，Ⅰ組和Ⅱ組灌服2%吐溫-80溶液，米糠甾醇各組灌服含2%吐溫-80的米糠甾醇溶液干預(yù)，連續(xù)13周。

1.3.2 米糠甾醇溶液的制備

米糠甾醇不溶于水和油，為增加大鼠對(duì)米糠甾醇的吸收利用，用2%吐溫-80溶液作為米糠甾醇溶劑。配制方法：精密稱取所需劑量米糠甾醇粉末，放入研缽內(nèi)不間斷研磨20min后，邊研磨邊緩慢加入2%吐溫-80溶劑，繼續(xù)研磨至充分混勻。將充分研磨混勻的米糠甾醇溶液隔水放入超聲波儀，超聲0.5h，得米糠甾醇混懸液，冷藏保存，每天給大鼠灌胃前隔水加熱至35℃，米糠甾醇溶液每3d配制一批。

1.3.3 標(biāo)本的采集和處理

第13周周末最后一次灌胃后，禁食12h，稱體質(zhì)量。4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，使用真空采血管進(jìn)行心臟采血，解剖取肝臟、脾臟稱質(zhì)量。計(jì)算其肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)。

采集的血液放4℃冰箱冷藏過夜，低溫離心機(jī)3500r/min離心10min，取上層血清放-70℃冷凍保存?zhèn)溆?。肝臟在稱質(zhì)量后立即放入4%甲醛溶液固定保存，數(shù)周后用石蠟包埋切片，HE法染色，光鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.3.4 指標(biāo)測(cè)定

SOD、NOS：實(shí)驗(yàn)第13周周末，心臟采血，4℃、3500r/min離心15min，取上層血清，按試劑盒說明操作。

血清血脂指標(biāo)檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)第13周周末，心臟采血，4℃、3500r/min離心15min，取上層血清，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)TC、TG、LDL-C和HDL-C含量。ALT、AST活力的測(cè)定按《基礎(chǔ)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)》[13]中方法檢測(cè)。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理方法

2 結(jié)果與分析

2.1 肝臟解剖結(jié)構(gòu)觀察

正常對(duì)照組肝臟表面光滑，顏色深紅，邊緣清晰。NASH模型組肝臟體積明顯腫大，色澤灰黃，肉眼可見明顯粗顆粒感，表面不光滑；米糠甾醇處理各劑量組肝臟的大體解剖結(jié)構(gòu)相對(duì)于NASH模型組都有一定程度改善，但與正常對(duì)照組比較仍可見脂肪性病變。

2.2 肝臟組織學(xué)觀察

圖1 肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)（×220000）Fig.1 Morphological structure of liver tissue (×200)

如圖1所示，圖1a中可觀察到炎癥細(xì)胞聚集浸潤(rùn)（→）；肝細(xì)胞明顯變大腫脹，細(xì)胞內(nèi)脂滴形成的空泡呈大囊泡性，且大囊泡已融合形成脂囊，胞漿內(nèi)脂滴將肝細(xì)胞核擠至細(xì)胞邊緣，部分細(xì)胞核裂解并可觀察到肝細(xì)胞有氣球樣變形態(tài)（←），且細(xì)胞間無間隙。圖1b中肝臟細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核與胞漿完好，肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)清晰完整，血竇清晰。圖1c中米糠甾醇低劑量組大部分細(xì)胞形態(tài)正常，大多肝細(xì)胞胞漿清晰，可觀察到的肝細(xì)胞脂肪空泡較少，未觀察到炎癥的聚集浸潤(rùn)；圖1d中米糠甾醇中劑量組肝細(xì)胞脂肪變性程度明顯低于NASH模型組，未觀察到炎癥的聚集浸潤(rùn)。圖1e中米糠甾醇高劑量組肝細(xì)胞脂肪空泡較米糠甾醇低、中劑量組有所增加，但大部分脂肪空泡還未融合，細(xì)胞核形態(tài)正?？梢?，與圖1a比較有明顯差異。

2.3 各組大鼠血清相關(guān)酶活性測(cè)定結(jié)果

表1 米糠甾醇對(duì)血清酶活性指標(biāo)的影響Table 1 Effect of RBS on serum enzyme activities

如表1所示，與正常對(duì)照組比較，NASH模型組ALT、AST極顯著升高（P＜0.001），AST/ALT比值極顯著下降（P＜0.001）；與NASH模型組比較，米糠甾醇各劑量組ALT和米糠甾醇低、中劑量組AST顯著降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），米糠甾醇各組AST/ALT比值明顯升高（P＜0.01，P＜0.001）。與正常對(duì)照組比較，NASH模型組NOS和SOD酶活性顯著升高（P＜0.001，P＜0.05）；與NASH模型組比較，米糠甾醇低劑量組NOS和SOD顯著降低（P＜0.001，P＜0.05）。

2.4 各組大鼠血清血脂含量測(cè)定結(jié)果

表2 米糠甾醇對(duì)大鼠血清血脂水平的影響Table 2 Effect of RBS on serum lipids concentration in rats

如表2所示，與正常對(duì)照組比較，NASH模型組HDL-C顯著降低（P＜0.01），與NASH模型組比較，米糠甾醇各組HDL-C均有升高，中劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在大鼠非酒精性脂肪性肝病肝炎階段，NASH模型組LDL-C和TC水平與正常 對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而米糠甾醇中劑量組LDL-C水平和米糠甾醇各劑量組TC水平與NASH模型組比較顯著升高（P＜0.05，P＜0.001）；NASH模型組TG水平低于正常對(duì)照組（P＜0.05），米糠甾醇各劑量組與模型組比較稍有升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 各組大鼠肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)測(cè)定結(jié)果

表3 米糠甾醇對(duì)大鼠器官指數(shù)的影響Table 3 Effect of RBS on organ indexes of rats

如表3所示，NASH模型組肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)，與正常對(duì)照組比較都顯著升高（P＜0.001和P＜0.05），米糠甾醇各劑量組的肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)與NASH模型組比較均有下降，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

3.1 米糠甾醇對(duì)高脂飼喂大鼠肝臟組織顯微結(jié)構(gòu)的影響

肝臟是脂類代謝的重要器官，它在脂類的吸收、運(yùn)輸、合成、貯存、分解等過程中均起到重要的作用。長(zhǎng)期攝入高脂肪、高熱量飲食會(huì)導(dǎo)致肝臟脂肪代謝紊亂，嚴(yán)重的脂肪肝可發(fā)展為脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬變。連續(xù)13周給與大鼠高脂飼料后，肝臟組織顯微組織結(jié)果顯示：正常對(duì)照組肝臟細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核與胞漿完好，肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)清晰完整，血竇清晰。NASH模型組肝臟脂肪變性嚴(yán)重，肝細(xì)胞明顯變大腫脹，細(xì)胞內(nèi)有大量的脂滴形成的空泡，同時(shí)有炎癥細(xì)胞的聚集浸潤(rùn)和部分肝細(xì)胞壞死。給予米糠甾醇的各干預(yù)組肝細(xì)胞脂肪病變明顯改善，大部分細(xì)胞呈小泡性脂肪變性，無炎癥的聚集浸潤(rùn)。說明采用米糠甾醇干預(yù)后，可明顯減輕由高脂飲食導(dǎo)致的脂肪肝病變，減緩大鼠非酒精性脂肪肝病病程。

3.2 米糠甾醇對(duì)高脂飼喂大鼠ALT和AST活性的影響

ALT主要存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)，其細(xì)胞內(nèi)濃度高于血清中1000～3000倍。只要有1%的肝細(xì)胞壞死，就可以使血清酶增高1倍。因此，ALT被世界衛(wèi)生組織推薦為肝功能損害最敏感的檢測(cè)指標(biāo)[14]。造模13周后，NASH模型組ALT活性大大升高，與正常對(duì)照組比較，差異極顯著（P＜0.001）。米糠甾醇低、中、高劑量組ALT活性雖然都高于正常對(duì)照組，但大大低于NASH組，二者差異極顯著（P＜0.001）。AST主要存在于肝細(xì)胞線粒體內(nèi)，當(dāng)肝臟發(fā)生嚴(yán)重壞死或破壞時(shí)，才能引起AST在血清中濃度偏高。造模13周后，NASH模型組AST活性升高，與正常對(duì)照組比較差異極顯著（P＜0.001），說明長(zhǎng)期飼喂高脂飼料，可導(dǎo)致肝細(xì)胞嚴(yán)重的損傷。米糠甾醇低、中劑量組AST活性低于NASH模型組，二者差異極顯著（P＜0.01，P＜0.001），但米糠甾醇高劑量組AST水平高于NASH模型組（P＜0.05），其原因還需進(jìn)一步討論。與NASH模型組比較，米糠甾醇各組AST/ALT比值均顯著升高（P＜0.01，P＜0.001），一般認(rèn)為正常范圍內(nèi)，AST/ALT比值越大，肝臟越健康[15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：一定劑量范圍內(nèi)的米糠甾醇能顯著降低高脂大鼠血清中ALT和AST活性，對(duì)高脂飼喂下的大鼠肝臟細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用。

3.3 米糠甾醇對(duì)高脂飼喂大鼠肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響

NASH組大鼠肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)都比正常對(duì)照組顯著升高（P＜0.001和P＜0.05），肝臟質(zhì)量顯著升高，符合NASH病癥特點(diǎn)，作為主要免疫器官之一的脾臟，其質(zhì)量增加原因可能是由肝臟損傷累及或肝臟炎癥引起的免疫應(yīng)答所致，米糠甾醇各劑量組臟器指數(shù)比NASH模型組均有下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.4 米糠甾醇對(duì)高脂飼喂大鼠SOD和NOS活性的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：NASH模型組血清SOD值與正常對(duì)照組比較顯著升高（P＜0.05），此結(jié)果與Zhao Jiasheng等[16]的研究結(jié)果一致，NASH大鼠血清SOD值顯著升高可能是由肝細(xì)胞壞死破損后大量SOD溢出入血所致；同時(shí)某些疾病也會(huì)導(dǎo)致血清抗氧化指標(biāo)升高，如機(jī)體炎癥和免疫反應(yīng)，會(huì)產(chǎn)生大量超氧自由基，誘導(dǎo)抗氧化酶的生成[17]，說明在肝炎階段，機(jī)體需要更多抗氧化酶來抵御氧化損傷。米糠甾醇低劑量組血清SOD值比NASH模型組顯著降低（P＜0.05），中、高劑量組也有所下降，提示米糠甾醇還具有消炎和/或清除自由基作用。NO在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮對(duì)抗細(xì)菌、病毒、腫瘤細(xì)胞等病原體的作用，但過量的NO也會(huì)起到毒性作用。內(nèi)毒素、細(xì)胞因子等能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞等吞噬細(xì)胞激活NOS，合成大量NO。NASH模型組血清NOS水平比正常對(duì)照組顯著上升（P＜0.001），說明NOS參與了NASH的形成發(fā)展。米糠甾醇低劑量組NOS水平（29.21±5.09）U/mL比NASH組顯著降低（P＜0.001），甚至低于正常對(duì)照組水平（30.18±9.36）U/mL。而血清NOS的升高與降低在NAFLD病程不同階段對(duì)機(jī)體具體起到何種作用，還需進(jìn)一步研究。

3.5 米糠甾醇對(duì)高脂飼喂大鼠血脂的影響

HDL-C被稱為“好膽固醇”，有抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用，NASH模型組血清HDL-C比正常對(duì)照組顯著降低（P＜0.01），HDL-C的降低是糖尿病、肝炎和肝硬化等疾病的典型病癥；米糠甾醇中劑量組血清HDL-C比NASH組顯著升高（P＜0.05），已接近正常對(duì)照組水平，說明該組與NASH模型組比較，清除外周膽固醇的能力增加。NASH模型組血清LDL-C水平和TC水平與正常對(duì)照組比較無顯著差異，NASH模型組血清TG水平比正常對(duì)照組顯著降低（P＜0.05）。理論上來說，高脂飼料飼喂進(jìn)行造模時(shí)，NASH模型組其血清TG和TC指標(biāo)應(yīng)該高于正常對(duì)照組，但據(jù)資料報(bào)道[18]，高脂高膽固醇飲食模型造模過程中，早期各項(xiàng)血脂指標(biāo)逐步上升，一般在第28天左右出現(xiàn)高峰值，后期可能保持一段時(shí)間的穩(wěn)定，之后會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。當(dāng)脂肪性肝病進(jìn)一步發(fā)展到肝硬化時(shí)，各項(xiàng)血脂水平下降越明顯，說明肝臟病變?cè)絿?yán)重[19]。本研究結(jié)果與張志平等[20]研究結(jié)果相似，NASH模型組大鼠血清TG水平與正常對(duì)照組比較有所下降。本實(shí)驗(yàn)時(shí)間為91d，肝臟顯微結(jié)構(gòu)觀察顯示NASH模型組肝臟脂肪變性嚴(yán)重，伴隨有炎癥細(xì)胞的聚集浸潤(rùn)和部分肝細(xì)胞壞死，這可能會(huì)導(dǎo) 致肝臟其合成TC和TG的能力降低，因此也就導(dǎo)致了NASH模型組TC和TG水平與正常對(duì)照組比較無差異甚至反而降低的結(jié)果，但具體原因還需要進(jìn)一步研究。米糠甾醇各劑量組血清TG水平與NASH模型組比較無顯著差異，說明米糠甾醇對(duì)TG無明顯干預(yù)作用。米糠甾醇各劑量組LDL-C和TC顯著高于NASH模型組（P＜0.05，P＜0.001），此結(jié)果進(jìn)一步提示米糠甾醇對(duì)大鼠非酒精性脂肪性肝病可能起到了延緩病程發(fā)展的作用。一定劑量范圍內(nèi)的米糠甾醇能有效預(yù)防大鼠非酒精性脂肪性肝炎。

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