劉 鷺，潘道東*，丁 琳，曾小群

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院食品系，浙江 寧波 315211）

多糖是一種由單糖聚合而成的天然高分子化合物，廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中[1]。乳酸菌是食品級(jí)的益生菌，其在生長過程中產(chǎn)生大量胞外多糖。乳酸乳球菌乳亞種（Lactococcus lactissubsp.lactis）是一種革蘭氏陽性菌，常被用于干酪生產(chǎn)。大量研究證實(shí)乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）具有免疫激活、抗腫瘤、降低血清膽固醇等作用[2-4]。硒是人體必需微量元素，適量補(bǔ)充硒元素可增強(qiáng)人體免疫能力[5]。通過化學(xué)修飾方法，亞硒酸鈉和多糖反應(yīng)后形成一種含有亞硒酸酯鍵的硒化多糖。該多糖低毒且可提高小鼠免疫能力[6]。

Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)參與信息傳遞，在生物體內(nèi)具有廣泛的作用，如突觸適應(yīng)、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、肌肉收縮、細(xì)胞分化和死亡等。細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的變化可引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列的生理生化反應(yīng)[7-9]。巨噬細(xì)胞作為機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在特異性免疫應(yīng)答及非特異性免疫防御中起著關(guān)鍵的作用[10]。為進(jìn)一步探討硒化乳酸菌胞外多糖的免疫功能，本實(shí)驗(yàn)利用激光共聚顯微鏡及Fluo-3/AM探針研究該多糖對(duì)巨噬細(xì)胞、SGC-7901胃癌細(xì)胞及Hela細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的變化，以期為開發(fā)一種多糖補(bǔ)硒添加劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

精制EPS及硒化EPS（硒含量169.228μg/g） 本實(shí)驗(yàn)室制備。

SGC-7901胃癌細(xì)胞、Hela細(xì)胞 武漢博士德生物工程有限公司；小牛血清 杭州四季青生物工程材料研究所；細(xì)菌脂多糖、Fluo-3/AM 美國Sigma公司；青霉素、鏈霉素、HEPES緩沖液 北京索萊寶科技有限公司；其余化學(xué)試劑均為分析純。

RPMI 1640培養(yǎng)基、RPMI 1640無酚紅培養(yǎng)基 美國Gibco公司。

1.2 動(dòng)物

ICR小鼠，體質(zhì)量18～22g，雄性，8周，由寧波大學(xué)動(dòng)物中心提供。

1.3 儀器與設(shè)備

370 FT-IR型傅里葉紅外光譜儀 美國Nicolet公司；MCO-18AIC CO2培養(yǎng)箱 日本Sanyon公司；飛鴿TDL-40C低速離心機(jī) 上海安亭儀器廠；倒置顯微鏡 日本Olympus公司；TCS SP5II激光共聚顯微鏡 德國萊卡公司。

1.4 方法

1.4.1 紅外光譜掃描

取適量硒化前或硒化后多糖粉末和溴化鉀混合研磨壓片，在4000～400cm-1范圍內(nèi)掃描。

1.4.2 巨噬細(xì)胞分離與培養(yǎng)

每只小鼠提前3d注射體積分?jǐn)?shù)為3%的巰基乙酸肉湯，3d后眼球放血，斷脊椎猝死小鼠。用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精浸泡后，剖開腹部皮膚，注射8mL預(yù)冷的1640培養(yǎng)基，2min后來回抽取腹水兩次，收集細(xì)胞。1000r/min離心5min，細(xì)胞沉淀用RPMI 1640培養(yǎng)基清洗兩遍。用臺(tái)盼藍(lán)染色確定活細(xì)胞大于95%，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105cells/mL。在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中貼壁3h后洗去非貼壁細(xì)胞得小鼠腹腔巨噬細(xì)胞[11-12]。

1.4.3 SGC-7901胃癌細(xì)胞培養(yǎng)

SGC-7901胃癌細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，用含有體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS-RPMI1640培養(yǎng)，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶和0.02% EDTA混合液消化傳代，隔天換液，4d傳代一次。加藥物刺激前細(xì)胞處于穩(wěn)定生長狀態(tài)。

1.4.4 Hela 細(xì)胞培養(yǎng)

Hela細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，用DMEM＋10% FBS培養(yǎng)，并用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合液消化傳代，每天換液，2d傳代一次。加藥物刺激前細(xì)胞處于穩(wěn)定生長狀態(tài)。

1.4.5 細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子[Ca2+]i測定

細(xì)胞貼壁后用Fluo-3/AM（終濃度5μmol/L）孵育45min，含鈣鎂離子的HEPES液清洗兩遍。置于激光共聚顯微鏡下，單通道激發(fā)波長488nm，吸收波長530nm。待穩(wěn)定后分別加入HEPES液或多糖（終質(zhì)量濃度為100μg/mL）。每5s測定一次熒光強(qiáng)度，連續(xù)測定12min[13-14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅外光譜掃描結(jié)果

圖1 乳酸菌胞外多糖硒化前后紅外光譜掃描對(duì)比圖Fig.1 Infrared spectra of EPS and Se-EPS

2.2 硒化乳酸菌胞外多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的影響

由圖2可知，激光共聚顯微鏡下巨噬細(xì)胞穩(wěn)定后加入Se-EPS溶液，細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光值緩慢升高并呈現(xiàn)動(dòng)蕩變化趨勢；加入同濃度EPS后有微弱動(dòng)蕩而加入HEPES液的對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光值無明顯變化。加入Se-EPS后巨噬細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度明顯大于未加Se-EPS前巨噬細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度。圖3為熒光顯微鏡下巨噬細(xì)胞的形態(tài)特征。

圖2 硒化多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度影響Fig.2 Effect of Se-EPS from Lactococcus lactis subsp. lactis on [Ca2+]i in mouse macrophages

圖3 熒光顯微鏡下的巨噬細(xì)胞形態(tài)Fig.3 Effect of Se-EPS from Lactococcus lactis lactis subsp. on [Ca2+]i in mouse macrophages examined by fluorescence microscope

2.3 硒化乳酸菌胞外多糖對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的影響

圖4 硒化多糖對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度影響Fig.4 Effect of Se-EPS from Lactococcus lactis subsp. lactis on [Ca2+]i in gastric cancer cells SGC-7901

如圖4所示，對(duì)照組和多糖組細(xì)胞12min內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度無明顯變化。胃癌細(xì)胞加入Se-EPS后細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)持續(xù)動(dòng)態(tài)下降趨勢。

2.4 硒化乳酸菌胞外多糖對(duì)Hela細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的影響

圖5 硒化多糖對(duì)Hela細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度影響Fig.5 Effect of Se-EPS from Lactococcus lactis subsp. lactis on [Ca2+]i in Hela cells

如圖5所示，Hela細(xì)胞加入Se-EPS后細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)持續(xù)動(dòng)態(tài)下降趨勢，且下降幅度較大，接近60%，反應(yīng)后階段細(xì)胞處于持續(xù)低鈣狀態(tài)。對(duì)照組和多糖組細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)動(dòng)蕩變化，但幅度較小。

3 討 論

在機(jī)體內(nèi)，Ca2+保持穩(wěn)態(tài)，對(duì)維持正常生理活動(dòng)有重要作用。作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，Ca2+參與多種細(xì)胞活動(dòng)[12]。Ca2+濃度的升高是巨噬細(xì)胞激活的一個(gè)早期表現(xiàn)，進(jìn)而引起細(xì)胞分化并分泌多種細(xì)胞因子，從而發(fā)揮其免疫細(xì)胞功能。對(duì)于腫瘤細(xì)胞而言，鈣內(nèi)流的減少可使細(xì)胞生長終止[16]。Fluo-3/AM是一種Ca2+探針，其在細(xì)胞內(nèi)被酯酶水解形成Fluo-3，后者與細(xì)胞內(nèi)Ca2+結(jié)合后熒光強(qiáng)度增強(qiáng)[17-18]，因此，熒光強(qiáng)度的變化可相應(yīng)地反映[Ca2+]i濃度的改變。本實(shí)驗(yàn)利用Fluo-3/AM標(biāo)記巨噬細(xì)胞及兩種腫瘤細(xì)胞，利用激光共聚顯微鏡技術(shù)測定硒化多糖的添加對(duì)這3種細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化的影響。結(jié)果顯示硒化多糖可使巨噬細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度緩慢升高，這提示通過對(duì)乳酸菌胞外多糖進(jìn)行硒化修飾可增強(qiáng)其刺激巨噬細(xì)胞的能力，這可能是由于通過修飾改變了多糖的結(jié)構(gòu)，使其可與細(xì)胞表面受體相結(jié)合，因而發(fā)揮其免疫功效。Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使之一，通過檢查細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的大小可間接反映細(xì)胞的生理狀況。實(shí)驗(yàn)中胃癌細(xì)胞與Hela細(xì)胞添加硒化多糖后，細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平均有不同程度的下降。這可能是硒化多糖與腫瘤細(xì)胞表面受體結(jié)合后引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度減少，細(xì)胞長期處于低鈣水平細(xì)胞機(jī)能將受到嚴(yán)重影響。提示硒化后的多糖可引起腫瘤細(xì)胞不同程度的細(xì)胞凋亡。細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化與細(xì)胞外Ca2+的流動(dòng)及細(xì)胞內(nèi)鈣泵的作用有關(guān)[19-20]，硒化多糖引起免疫細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞Ca2+變化的作用機(jī)制還需要更加深入的研究。

多糖通過硒化修飾得到的硒與多糖化合物結(jié)合了兩種物質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)，增加了多糖的免疫功能，并且提供了一種高效低毒的補(bǔ)硒劑。乳酸菌胞外多糖的硒化修飾在一定程度上改變了其生物活性以及作用機(jī)制，然而其對(duì)免疫功能的影響以及作用機(jī)制還需要進(jìn)行更深層次的研究。

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