宋程光 楊 鑫 閔連秋 劉長喜

1.中國醫(yī)科大學本溪中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧本溪 117000；2.遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧錦州 121001

糖尿病是缺血性腦血管病的獨立危險因素，其發(fā)生腦梗死的危險性是普通人的2～3 倍[1]。 腦梗死是2型糖尿病最常見的大血管并發(fā)癥，也是2 型糖尿病患者最常見的死亡原因，其發(fā)病后的癥狀重、預后差、病死率高。 本研究通過檢測神經(jīng)行為學評分，神經(jīng)細胞數(shù)以及STAT1 的表達情況來探討原花青素（PC）對2型糖尿病局灶性腦缺血的保護作用。

Janus 激酶/信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子（JAK/STAT）途徑是眾多細胞因子信號轉(zhuǎn)導的重要途徑，一直是學者們研究的熱點。 細胞因子與其受體結(jié)合后激活JAK，進一步激活STAT，再誘導其下游的目的基因表達。近來研究表明，JAK/STAT 途徑是人體內(nèi)生理和病理反應的共同傳導通路之一，該途徑與多種疾病發(fā)病及防治密切相關[2-4]。腦缺血時能釋放大量細胞因子和生長因子，這些因子能夠激活JAK/STAT 信號通路，現(xiàn)已證實腦缺血可以誘導STAT1 蛋白表達增加[5]，使JAK/STAT 信號通路激活。STAT1 能抑制細胞生長，介導細胞凋亡過程中的信號傳導，并能負性調(diào)節(jié)cMyc 啟動子的表達，參與細胞凋亡的誘導[6]。

本實驗研究PC 對2 型糖尿病局灶性腦缺血大鼠腦組織中STAT1 表達的影響，來探討原花青素對2型糖尿病大鼠局灶性腦缺血的保護作用及其機制，為其臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

SD 大鼠由遼寧醫(yī)學院動物實驗中心提供；PC 由天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司提供（批號：6050804）。 Rabbit Anti-STAT1 蛋白試劑盒、生物素化二抗、DAB 濃縮顯色液、DAB 稀釋液均由武漢博士德生物試劑公司提供。 膽酸鈉、膽固醇由鄭州利偉生物實業(yè)有限公司提供，鏈脲佐菌素（STZ）由廈門星隆達化學試劑有限公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組

SD 大鼠75 只，雌雄各半，隨機分為假手術組，2型糖尿病合并腦缺血組，PC 低、中、高劑量組，每組各15 只。 PC 組在建立2 型糖尿病模型后給予灌胃，1 次/24 h，連續(xù)1 周，于大腦中動脈缺血（middle cerebral arteryocclusion，MCAO）術前1 h 再灌胃1 次。PC 低、中、高劑量組分別以PC 粉劑50、100、200 mg/（kg·次），蒸餾水配制成懸浮液灌胃。

1.2.2 模型制作

各組均先喂以高脂高糖飼料（10%煉豬油，2.5%膽固醇，20%蔗糖，2%膽酸鈉，65.5%普通飼料[7]）4 周，誘發(fā)出胰島素抵抗，然后以鏈脲佐菌素（STZ）小劑量（25 mg/kg）腹腔注射1 次，穩(wěn)定3 d 后，測定大鼠尾尖血血糖，空腹血糖＞16.7 mmol/L 的大鼠判定為2 型糖尿病大鼠。

以線栓法制作MCAO 模型[8-9]，大鼠用10%的水合氯醛（0.3 mL/100 mg）腹腔注射麻醉后，暴露并鈍性游離左側(cè)頸總動脈（CCA），結(jié)扎同側(cè)CCA 近心端和頸外動脈（ECA）分叉部，距CCA 末端約5 mm 處剪口，選用頭端燒成光滑杵狀的國產(chǎn)尼龍線（直徑0.235 mm，長6 cm）插入，以頸總動脈分叉處計算進線深度為（18.0±0.5） mm，至大腦中動脈起始部以完全阻斷血供。 模型成功的標志是大鼠即刻出現(xiàn)左側(cè)Horner 征。 排除有蛛網(wǎng)膜下腔出血者。 假手術組除不插入線栓外，其他操作步驟同上。手術過程中，用加熱墊和燈泡保持肛溫在37.0～37.5℃。

1.2.3 檢測指標

1.2.3.1 神經(jīng)功能缺損評分 MCAO 術后24 h 采用Bederson[10]6 級5 分評分標準進行神經(jīng)行為學評估，5級0 分：正常（無功能障礙）；4 級1 分：對側(cè)上肢不能完全伸展；3 級2 分：向?qū)?cè)推時抵抗力下降；2 級3 分：提尾時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；1 級4 分：自動轉(zhuǎn)圈；0 級5 分：無自發(fā)性活動伴意識障礙。

1.2.3.2 HE 染色 MCAO 術后24 h，大鼠以10%水合氯醛（0.3 mL/100 mg）腹腔注射麻醉，打開頸部，暴露頸右總動脈，插管，先輸注生理鹽水約50 mL，然后輸注4%多聚甲醛約50 mL，斷頭取腦。 甲醛固定，冠狀腦片制備，選擇梗死中心（即最大層面），常規(guī)酒精脫水，石蠟包埋，制成4～6 μm 厚的切片，附片，行蘇木精-伊紅（HE）染色：60℃烤箱過夜，二甲苯脫蠟后逐級酒精浸水，蘇木精浸染，1%鹽酸酒精分色，自來水漂洗，蒸餾水返藍30 min，鏡檢使細胞核呈藍紫色，其余結(jié)構基本無色。 伊紅染液浸染后蒸餾水洗，逐級酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。觀察并計數(shù)海馬區(qū)神經(jīng)細胞。

1.2.3.3 免疫組化法 采用免疫組化法檢測缺血側(cè)大腦皮質(zhì)STAT1 的表達，MCAO 術后24 h，大鼠取腦步驟同HE 染色，取雙側(cè)大腦冠狀位距嗅球尖端6～11 mm的腦組織塊，放入4%多聚甲醛固定液中繼續(xù)固定24 h，常規(guī)梯度脫水、透明、石蠟包埋。 從冠狀面中1/3層面開始留取切片，厚度5 μm，連續(xù)切片，切片貼附于經(jīng)APES 處理的載玻片上，備用。 用免疫組化法測定，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 11.5 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)行為學評分情況

與假手術組比較，2 型糖尿病合并腦缺血組的神經(jīng)行為學評分明顯增高，PC 各劑量組均能改善2 型糖尿病局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)行為學評分，其中PC 中、高劑量組效果比低劑量組更明顯，但PC 中、高劑量組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。 見表1。

表1 各組神經(jīng)行為學評分情況（分，±s）

表1 各組神經(jīng)行為學評分情況（分，±s）

注：與假手術組比較，▲P < 0.01；與2 型糖尿病腦缺血組比較，■P <0.05，*P < 0.01；與PC 低劑量組比較，#P < 0.05；PC：原花青素

?

2.2 各組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)神經(jīng)細胞計數(shù)

PC 各組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)神經(jīng)細胞數(shù)均明顯增多，其中PC 中、高劑量組效果比低劑量組更明顯，但PC 中、高劑量組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表2。

表2 原花青素對各組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)神經(jīng)細胞計數(shù)的影響（個/HP，±s）

表2 原花青素對各組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)神經(jīng)細胞計數(shù)的影響（個/HP，±s）

注：與假手術組比較，▲P < 0.01；與2 型糖尿病腦缺血組比較，*P <0.01；與PC 低劑量組比較，#P < 0.01；PC：原花青素

?

2.3 不同劑量PC 對2 型糖尿病局灶性腦缺血大鼠大腦皮質(zhì)STAT1 陽性細胞表達率的影響

PC 各組均能減少2 型糖尿病局灶性腦缺血大鼠腦組織中STAT1 的含量，其中PC 中、高劑量組效果比低劑量組更明顯，但PC 中、高劑量組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。 見表3、圖1。

表3 原花青素對各組大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子1 陽性細胞表達率的影響（個/HP，±s）

表3 原花青素對各組大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子1 陽性細胞表達率的影響（個/HP，±s）

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注：與假手術組比較，▲P<0.01；與2 型糖尿病腦缺血組比較，*P<0.01；與PC 低劑量組比較，#P < 0.01；PC：原花青素；STAT1：信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子1

圖1 原花青素各組大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子1 陽性細胞表達（SABC×400）

3 討論

糖尿病對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響隨著此類患者的增多越來越受到人們的重視。糖尿病除了引起周圍神經(jīng)病變外，還表現(xiàn)出腦血管病發(fā)病率升高，糖尿病患者可能會合并其他并發(fā)癥，如高血壓、高脂血癥、自主神經(jīng)病、動脈粥樣硬化的加速、血小板黏附和聚集能力升高、紅細胞變形能力降低、纖溶活性受損、血黏度高、腦實質(zhì)內(nèi)增殖性小血管病等，而且糖尿病缺血性卒中時可以有應激性高血糖的產(chǎn)生，以上因素都加重缺血性腦損傷。

JAK/STAT 通路是一條重要的信號轉(zhuǎn)導途徑，它的一個十分重要的作用就是轉(zhuǎn)導細胞因子信號。該途徑是一種比較簡單的轉(zhuǎn)錄化轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，不需要第二信使，其通過穿膜受體將細胞外多肽信號信息直接傳送到核內(nèi)的靶基因啟動子，進而發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄活化子蛋白與信號轉(zhuǎn)導子的作用[11-13]。

PC 具有降低毛細血管通透性、抗氧化的藥理作用[14-15]，其含有大量的活性酚羥基，這種化學結(jié)構使其具有很強的清除各種活性氧自由基及抗氧化的能力。已有研究證實原花青素可通過清除缺血局部血管內(nèi)皮細胞的氧自由基和抗氧化作用而應用于治療和預防心肌缺血-再灌注損傷[16]，從藥理機制和腦血管病發(fā)病機制上看，PC 對缺血性腦血管病應有較好的作用。

近來有研究認為STAT1 有促進凋亡的作用[17-19]。Takagi 等[17]將小鼠STAT1 基因敲除，制備STAT1 基因缺陷小鼠，發(fā)現(xiàn)這種小鼠有抗缺血能力，表現(xiàn)為腦梗死面積明顯小于野生型小鼠， 并且TUNEL 陽性細胞顯著減少，神經(jīng)功能缺損也明顯減輕。為了探索STAT1基因缺陷小鼠抗缺血損傷的具體機制，筆者發(fā)現(xiàn)再灌注2 h 后Akt 絲氨酸473 位點磷酸化較野生型小鼠明顯，而缺血誘導的c-Jun 氨基末端激酶（JNK）、P38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）磷酸化在兩型小鼠之間的差異并不明顯，提示STAT1 可能具有調(diào)節(jié)Akt 活化的作用。 此外，STAT1 基因缺陷小鼠半光氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的活化明顯低于野生型小鼠。 Stephanou 等[20]報道STAT1 可以降低Bcl-2和Bcl-x 的表達，而Bcl-2 和Bcl-x 是腦缺血再灌注損傷中很重要的抗凋亡基因，提示了在腦缺血損害過程中STATl 的促凋亡作用。腦缺血能誘導磷酸化STAT1蛋白活化及核轉(zhuǎn)位，它們通過調(diào)節(jié)與凋亡和細胞死亡相關蛋白Caspase-3 的轉(zhuǎn)錄與磷酸化參與了缺血性腦損傷的過程。

在本研究中，2 型糖尿病局灶性腦缺血組大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)STAT1 表達較假手術組明顯增多（P <0.01），說明STAT1 可能在2 型糖尿病合并腦缺血時起到重要作用，推測其機制可能為2 型糖尿病合并腦缺血時能引起大量細胞因子和生長因子的釋放，誘導磷酸化STAT1 蛋白活化及核轉(zhuǎn)位，激活JAK/STAT1 信號通路，它們能通過調(diào)節(jié)與凋亡和細胞死亡相關蛋白Caspase-3 的轉(zhuǎn)錄與磷酸化和其他途徑參與了缺血性腦損傷的過程，發(fā)揮了其促凋亡作用[21]。 PC 各組均能使2 型糖尿病局灶性腦缺血大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)STAT1 表達下調(diào)，其中PC 中、高劑量組效果更明顯。推測PC 可能通過抑制STAT1 的表達而起到抑制JAK/STAT1 通路，最終抑制了其促凋亡作用，從而起到了對2 型糖尿病局灶性腦缺血大鼠的保護作用。

由于動物和人體有巨大的差異且缺血機制復雜，可能阻斷單一環(huán)節(jié)的藥物都不一定奏效[22]。因此對PC的進一步研究，將為治療糖尿病合并腦梗死提供更為可靠的理論依據(jù)。

[1] Capes SE，Hunt D，Malmberg K，et al. Stress hyperglycemia and prognosis of stroke in nondiabetic and diabetic patients：a systematic overview [J]. Stroke，2001，32（10）：2426-2432.

[2] Klampfer L. Signal transducers and activators of transcription（STATs）：Novel targets ofchemopreventive and chemotherapeutic drugs [J]. Curr Cancer Drug Targets，2006，6（2）：107-121.

[3] Shouda T，Hiraoka K，Komiya S，et al.Suppression of IL-6 production and proliferation by blocking STAT3 activation in malignant soft tissue tumor cells[J]. Cancer Lett，2006，231（2）：176-184.

[4] FolchPuy E，Granell S，Dagom JC，et al. Pancreatitis-associated protein I suppresses NF -kappa B activation through a JAK/STAT-mediated mechanism in epithelial cells [J]. J Immunol，2006，176（6）：3774-3779.

[5] 曹貴方，楊期東，袁存國，等.局灶性腦缺血再灌注信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活子1 的表達與磷酸化[J].中國臨床康復，2006，10（18）：76-78.

[6] Amana CV，Grammatikakis N，Chernov M，et al. Regulation of c-myc expression by IFN-through Stat1 dependent and-independent pathways [J]. EMBO J，2000，19（2）：263-272.

[7] 郭嘯華，劉志紅，李恒，等.高脂高糖誘導的2 型糖尿病大鼠模型及其腎病特點[J].中國糖尿病雜志，2002，10（5）：290-294.

[8] 賈玉潔，閔連秋，季占勝，等.原花青素對腦缺血后抑凋亡基因蛋白Bcl-2 和促凋亡基因蛋白Bax 的影響[J].中國臨床康復，2006，10（23）：65-72.

[9] 李冬果，韓松，劉翠英，等.低氧預適應和大腦中動脈阻塞小鼠腦內(nèi)差異microRNAs 鑒定[J].北京生物醫(yī)學工程，2013，32（5）：456-462.

[10] Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development of a neurologic examination [J]. Stroke，1986，17（3）：472-476.

[11] Klampfer L.Signal transducers and activators of transcription （STATs）：Novel targets of chemopreventive and chemotherapeutic drugs[J].Curr Cancer Drug Targets，2006，6（2）：107-121.

[12] Shouda T，Hiraoka K，Komiya S，et al.Suppression of IL-6 production and proliferation by blocking STAT3 activation in malignant soft tissue tumor cells [J]. Cancer Lett，2006，231（2）：176-184.

[13] FolchPuy E，Granell S，Dagom JC，et al. Pancreatitis-associated protein I suppresses NF-kappa B activation through a JAK/STAT-mediated mechanism in epithelial cells [J]. J Immunol，2006，176（6）：3774-3779.

[14] Yamaguchi F，Yoshimura Y，Nakazawa H，et al. Free radical scavenging activity of grape seed extract and antioxidants by electron spin resonance spectrometry in an H（2）O（2）/NaOH/DMSO system [J]. J Agric Food Chem，1999，47（7）：2544-2548.

[15] Sinatra ST，DeMarco J.Free radicals，oxidative stress，oxidized low density lipoprotein （LDL），and the heart：antioxidants and strategies to limit cardiovascular damage [J].Conn Med，1995，59（10）：579-588.

[16] Facino RM，Carini M，Aldini G，et al. Diet enriched with procyanidins enhances antioxidants activity and reduces myocardial post-ischaemic damage in rats [J]. Life Sci，1999，64（8）：627-642.

[17] Takagi Y，Harada J，Chiarugi A，et al. STAT1 is activated in neurons after ischemia and contributes to ischemic brain injury [J]. J Cereb Blood Flow Metab，2002，22（11）：1311-1318.

[18] Chin YE，Kitagawa M，Kuida K，et al.Activation of the STAT signaling pathway can cause expression of caspase 1 and apoptosis [J]. Mol Cell Biol，1997，17（9）：5328-5337.

[19] Stephanou A，Scarabelli TM，Brar BK，et al. Induction of apoptosis and Fas receptor/Fas ligand expression by ischemia/reperfusion in cardiac myocytes requires serine 727 of the STAT-1 transcription factor but not tyrosine 701 [J]. J Biol Chem，2001，276（30）：28340-28347.

[20] Stephanou A，Brar BK，Knight RA，et al. Opposing actions of STAT-1 and STAT-3 on the Bcl-2 and Bcl-x promoters [J]. Cell Death Differ，2000，7（3）：329-330.

[21] 劉冬云，侯云生，王天軼，等.JAK/STAT 信號通路在大鼠缺血再灌注心肌損傷中的表達[J].臨床誤診誤治，2012，25（5）：87-89.

[22] 王擁軍.從缺血損害的分子機制到未來神經(jīng)保護劑的發(fā)展方向[J].中華老年心腦血管病雜志，2001，3（4）：219-220.