姚 剛 趙繼福 黃 倩 于挺敏▲

1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林長(zhǎng)春 130041；2.長(zhǎng)春市中醫(yī)院內(nèi)科，吉林長(zhǎng)春 130022

降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP） 是內(nèi)源性痛覺(jué)調(diào)制系統(tǒng)中重要的中介物質(zhì)， 拮抗和減弱內(nèi)源性阿片肽在中腦的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，參與調(diào)節(jié)內(nèi)源性痛覺(jué)調(diào)制系統(tǒng)的功能[1-2]。頭痛寧膠囊對(duì)多種慢性頭痛（如偏頭痛、緊張型頭痛等）均有較為滿意的療效[3-4]。 該藥對(duì)內(nèi)源性痛覺(jué)調(diào)制系統(tǒng)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)——中腦CGRP 的表達(dá)是否產(chǎn)生影響目前尚無(wú)相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察頭痛寧膠囊對(duì)偏頭痛模型大鼠中腦CGRP mRNA 表達(dá)的影響，探討該藥對(duì)偏頭痛的治療機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

頭痛寧膠囊（咸陽(yáng)步長(zhǎng)制藥有限公司）；硝酸甘油注射劑（山西康寶生物制品股份有限公司）；RNAiso Reagent、RNA PCR Kit （AMV）Ver.3.0、E.coli DH5α、pEASY-T1 Vector、限制酶BamH Ⅰ和EcoR Ⅴ、SYBR Premix Ex TaqTM均購(gòu)自大連TaKaRa 公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 及AxyPrep Plasmid Miniprep Kit購(gòu)自Axygen Biosciences 公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。PCR 儀（Perkin Elmer GeneAmp PCR system2400）；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（MIKRO 22R zentrifugen）；超低溫冰箱（MDF-382E）；Sub-Cell GT（Agarose Gel Electrophoresis Systems，BIO-RAD）；BIO-RAD Power PAC 200/300穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀；凝膠成像系統(tǒng)（Kada）；紫外分光光度計(jì)（UV-2401PC，Shimadzu），軟件：UVPC version 3.9；定量PCR 儀（ABI PRISM 7500）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組、藥物干預(yù)、造模

健康Wistar 大鼠24 只，雌雄各半，200～220 g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。 24 只健康成年Wistar 大鼠，隨機(jī)分為4 組：對(duì)照組（A 組），偏頭痛組（B 組），頭痛寧膠囊對(duì)照組（C 組），頭痛寧膠囊治療組（D 組），每組6 只。 根據(jù)成人每日口服劑量換算得到實(shí)驗(yàn)大鼠給藥劑量，頭痛寧膠囊對(duì)照組和頭痛寧膠囊治療組給予頭痛寧膠囊0.375 g/（kg·d）灌胃，對(duì)照組、偏頭痛組給予生理鹽水2 mL/d 灌胃給藥，連續(xù)給藥7 d 后， 偏頭痛組和頭痛寧膠囊對(duì)照組大鼠制備偏頭痛大鼠模型 （臀部皮下注射硝酸甘油注射劑10 mg/kg），以造模大鼠出現(xiàn)爬籠次數(shù)增多、前肢頻繁搔頭、往返運(yùn)動(dòng)、咬尾等不適的癥狀為造模成功的指標(biāo)[6]。 對(duì)照組和頭痛寧膠囊對(duì)照組大鼠皮下注射生理鹽水2 mL/kg。

1.2.2 標(biāo)本采集

造模2 h 時(shí)10%水合氯醛麻醉大鼠（0.3 mL/100 g），取腦，分離中腦，-70℃保存。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR

1.2.3.1 cDNA 合成 按RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各組大鼠中腦總RNA。 MgCl24 μL， RNase Inhibitor 0.5 μL， AMV Reverse Transcriptase 1 μL，5×RT Buffer 4 μL，dNTP Mixture （各10 mmol/L）2 μL，Random 9 mers 1 μL， 總RNA 250 ng， 以及RNase Free dH2O，總體積為20 μL。 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：30℃10 min，42℃30 min，99℃5 min，5℃5 min。

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品制備 CGRP 引物上游5'-AAGTTCTCCCCTTTCCTGGT-3'，下游5'-GGTGGGCACAAAGTTG TCCT-3'。 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：變性（94℃30s），退火（53℃30 s），延伸（72℃30 s），35 個(gè)循環(huán)。 試劑盒回收、純化PCR 擴(kuò)增的目的基因，與pEASY-T1 載體連接，之后轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α 中，氨芐青霉素篩選，試劑盒提取質(zhì)粒，限制酶BamH Ⅰ、EcoR Ⅴ雙酶切鑒定及測(cè)序，證實(shí)CGRP cDNA 全長(zhǎng)完全正確。 計(jì)算所提取質(zhì)粒的拷貝數(shù)（測(cè)OD260值），作為標(biāo)準(zhǔn)品（無(wú)菌水10 倍系列稀釋后分裝），-20℃保存。

1.2.3.3 SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)定量PCR SYBR Premix ExTaqTM10 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL， 上下游引物各0.4 μL（10 μmol/L），cDNA 標(biāo)本2.0 μL，dH2O 6.8 μL，總反應(yīng)體系為20 μL。 10 倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，同時(shí)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。各標(biāo)本均做3 個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)條件：變性（94℃30 s），退火（53℃30 s），延伸（72℃30 s），共40個(gè)循環(huán)。 同時(shí)進(jìn)行熔解曲線分析，分析模式：95℃15 s，60℃20 s，95℃15 s。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析， 計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差別采用單因素方差分析和Tukey 比較，以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CGRP 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品

采用普通PCR 獲得CGRP 基因擴(kuò)增產(chǎn)物，純化回收，與pEASY-T1 載體連接成為重組質(zhì)粒（標(biāo)準(zhǔn)品），質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過(guò)雙酶切鑒定與預(yù)期結(jié)果一致，測(cè)序結(jié)果回報(bào)所克隆序列同靶基因序列的同源性達(dá)100%。

2.2 CGRP 標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線

利用10 倍系列稀釋的CGRP 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制作PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線。 基因檢測(cè)的下限為2.7×103拷貝/μL，檢測(cè)的上限為2.7×109拷貝/μL， 回歸方程Ct=-2.69Log（x）+38.875，r=0.993，線性范圍達(dá)7 個(gè)數(shù)量級(jí)（圖1）。

圖1 降鈣素基因相關(guān)肽基因標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 產(chǎn)物特異性

熔解曲線分析結(jié)果顯示，10 倍系列稀釋的CGRP質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品PCR 產(chǎn)物熔解曲線峰值均在88℃， 峰形銳利，說(shuō)明產(chǎn)物特異。

2.4 各組大鼠中腦CGRP mRNA 表達(dá)量

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算機(jī)可直接計(jì)算出各標(biāo)本模板的CGRP mRNA 初始含量（圖2）。各標(biāo)本PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線峰值也在88℃，說(shuō)明產(chǎn)物特異。 各組大鼠中腦每250 ng 總RNA 中腦CGRP mRNA 拷貝數(shù)分別為（1.13±0.68）×104、（1.61±0.51）×104、（0.80±0.45）×104、（0.75±0.27）×104。 A、B 組大鼠中腦CGRP mRNA拷貝數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；C、D 組大鼠中腦CGRP mRNA 拷貝數(shù)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；C、D 組大鼠中腦CGRP mRNA 拷貝數(shù)比較，明顯低于B 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

圖2 各組大鼠中腦CGRP mRNA 表達(dá)情況

3 討論

頭痛寧膠囊由天麻、土茯苓、制何首烏、防風(fēng)、全蝎、當(dāng)歸六味藥材按照GMP 標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格生產(chǎn)的中成藥制劑。 多數(shù)單藥組分具有鎮(zhèn)痛作用，天麻具有鎮(zhèn)靜、安神、減輕頭痛等作用[7]。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，土茯苓能明顯提高小鼠的熱板痛閾值[8]。 當(dāng)歸的抗氧化和抗自由基效應(yīng)，起到神經(jīng)保護(hù)的作用[9]。 全蝎中含有的蝎毒多肽具有很強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用。 有研究發(fā)現(xiàn)：頭痛寧膠囊可以上調(diào)偏頭痛大鼠中腦腦啡肽原mRNA 的表達(dá)，進(jìn)而增加與內(nèi)源性鎮(zhèn)痛直接相關(guān)的兩種腦啡肽 （甲硫氨酸腦啡肽和亮氨酸腦啡肽）在中腦的含量，說(shuō)明頭痛寧膠囊對(duì)內(nèi)源性痛覺(jué)調(diào)制系統(tǒng)的功能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[10]。

內(nèi)源性痛覺(jué)調(diào)制系統(tǒng)的核心結(jié)構(gòu)是中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)（periaqueductal gray，PAG），凡是由激活更高中樞所產(chǎn)生的鎮(zhèn)痛效應(yīng)， 大部分都被證明是通過(guò)PAG 才得以實(shí)現(xiàn)的， 這充分體現(xiàn)了PAG 在痛覺(jué)調(diào)制中的重要性[11-12]。 PAG 與延髓頭端腹內(nèi)側(cè)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)相連接，調(diào)節(jié)脊髓背角的痛覺(jué)初級(jí)傳入活動(dòng)，這一過(guò)程通過(guò)下行抑制通路得以實(shí)現(xiàn)。 CGRP 作為內(nèi)源性痛覺(jué)調(diào)制系統(tǒng)中重要的中介物質(zhì)，參與疼痛與鎮(zhèn)痛過(guò)程。

本研究以頭痛寧膠囊為干預(yù)因素，觀察其對(duì)硝酸甘油型偏頭痛大鼠中腦CGRP 表達(dá)的影響，進(jìn)一步觀察頭痛寧膠囊對(duì)內(nèi)源性痛覺(jué)調(diào)制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，探討其治療偏頭痛的中樞機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)建立的檢測(cè)大鼠CGRP 基因的實(shí)時(shí)定量PCR 方法，具有很高的敏感性和重復(fù)性，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果精確可靠。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：以頭痛寧膠囊作為干預(yù)因素的偏頭痛大鼠， 其中腦CGRP mRNA 表達(dá)明顯低于偏頭痛模型大鼠，說(shuō)明頭痛寧膠囊對(duì)偏頭痛大鼠中腦CGRP 基因表達(dá)具有抑制作用。

CGRP 與偏頭痛關(guān)系極為密切，在外周，CGRP 是最有效的血管擴(kuò)張肽[13]，CGRP 與位于腦血管平滑肌的CGRP 受體結(jié)合導(dǎo)致腦血管異常擴(kuò)張[14-15]，引發(fā)頭痛。三叉神經(jīng)血管末梢釋放的CGRP 可觸發(fā)腦膜肥大細(xì)胞脫顆粒，進(jìn)而引發(fā)一系列生物學(xué)反應(yīng)，誘發(fā)腦膜神經(jīng)源性炎癥[16]，導(dǎo)致頭痛發(fā)生。 除此以外，CGRP 還是三叉神經(jīng)脊束核中傷害性感受神經(jīng)元的神經(jīng)調(diào)質(zhì)[17]，傳遞痛覺(jué)信息。 在中腦，CGRP 的主要作用是拮抗內(nèi)源性阿片肽的鎮(zhèn)痛效應(yīng)[18]。 本研究發(fā)現(xiàn)頭痛寧膠囊可以下調(diào)偏頭痛大鼠中腦CGRP 的基因表達(dá)，由此認(rèn)為頭痛寧膠囊治療偏頭痛的機(jī)制與其抑制中腦CGRP的表達(dá)有關(guān)。

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