熒光標(biāo)記法測定菌落總數(shù)

張永帥，孫俊良，梁新紅，李元召

（河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

熒光標(biāo)記法測定菌落總數(shù)

張永帥，孫俊良*，梁新紅，李元召

（河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

采用一種新型破膜劑麝香草酚將微生物細(xì)胞壁完全破裂，再用碘化丙啶熒光標(biāo)記微生物核酸或DNA，測定熒光值。建立工作曲線，根據(jù)熒光值在工作曲線上查出菌落總數(shù)。結(jié)果表明，破膜劑麝香草酚的最適濃度為4 mmol/L，本方法測定枯草芽孢桿菌菌落數(shù)對應(yīng)熒光值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.29%，回收率為98.4%。方法準(zhǔn)確可靠，而且不需要大量鋪平板，簡便快速。

熒光標(biāo)記；菌落總數(shù)；麝香草酚

食品安全全球關(guān)注，已成為繼人口、資源、環(huán)境之后第四大社會(huì)問題。食品中有害污染物，包括物理、化學(xué)、生物性污染物等，嚴(yán)重危及人類健康、生命安全，微生物污染造成食源性疾病仍是世界食品安全中最突出問題[1]。對食品中病原菌、腐敗菌或指示菌可通過各種方法進(jìn)行檢測。傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法仍是標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)橐后w肉湯和固體瓊脂培養(yǎng)基中靶細(xì)菌的存在及計(jì)數(shù)是其增殖能力的有力證據(jù)[2]。

GB/T 4789.2—2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)：菌落總數(shù)測定》規(guī)定兩種測定方法，第1法為平板菌落計(jì)數(shù)法；第2法為菌落總數(shù)PetrifilmTM測試片法。平板菌落計(jì)數(shù)法要求嚴(yán)格，需要一定專業(yè)操作技能,操作復(fù)雜且工作量大。相比GB/T 4789.2—2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)：菌落總數(shù)測定》，GB/T 4789.2—2008增加第2法（菌落總數(shù)Petrifi lmTM測試片法）。與第1法比較，第2法省去配制培養(yǎng)基、消毒和培養(yǎng)器皿清洗消毒、實(shí)驗(yàn)廢棄物滅菌處置等大量輔助性工作，勞動(dòng)強(qiáng)度減輕、材料成本降低、操作程序簡化。兩種測試法中規(guī)定：一般食品（36±1）℃培養(yǎng)（48±2）h，水產(chǎn)品（30±1）℃培養(yǎng)（72±3）h[3]。但在實(shí)際情況中，有些食品如面包、蛋糕保存期僅兩三天，有些食品如饅頭、米飯等是當(dāng)天生產(chǎn)當(dāng)天銷售完，基本沒有庫存，實(shí)時(shí)采集樣品，采用國家標(biāo)準(zhǔn)測定方法獲得檢測結(jié)果意義有限。由此，快速檢測技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，并由培養(yǎng)水平向分子水平邁進(jìn)；特別 是近年隨分子生物學(xué)、微電子技術(shù)及生物技術(shù)發(fā)展，微生物快速檢驗(yàn)技術(shù)已有很大發(fā)展。

近幾年，生物電化學(xué)方法、阻抗法、伏安分析法、電位電流分析法等快速檢測技術(shù)已經(jīng)得到發(fā)展，而且新的技術(shù)也在不斷產(chǎn)生[4-18]。有研究[19-20]表明腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）生物發(fā)光法是利用產(chǎn)生于生物體內(nèi)化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象建立的一種檢測方法，即在一個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)中，當(dāng)蟲光素酶和蟲熒光素處于過量情況下，熒光強(qiáng)弱取決于ATP數(shù)量。因此，在檢測含細(xì)菌樣品時(shí)，細(xì)菌細(xì)胞越多，ATP量越高，發(fā)出熒光也就越強(qiáng)。由于蟲光素酶對ATP反應(yīng)非常靈敏，熒光強(qiáng)弱可通過熒光儀計(jì)量。所以，在排除樣品中非細(xì)菌ATP干擾情況下，通過熒光值就能確定樣品中細(xì)菌ATP量，通過相對熒光值和細(xì)菌細(xì)胞數(shù)關(guān)系曲線，就能快速確定樣品中細(xì)菌細(xì)胞數(shù)[21]。本實(shí)驗(yàn)采用碘化丙啶熒光標(biāo)記DNA或核酸，通過測熒光值確定菌落總數(shù)，方法快速、可靠。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

枯草芽孢桿菌168、酵母菌和黃曲霉菌 中國工業(yè)微生物菌種管理保藏中心；20 g/100 mL十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfat，SDS）溶液；20 g/100 mL Triton溶液；20 mmol/L麝香草酚溶液；碘化丙啶（propidium iodide，PI）、溴化乙錠（ethidium bromide，EB）和GoldView寶生物工程有限公司；其余試劑均為分析純。

VariosKan Flash型多功能酶標(biāo)儀 美國賽默飛世爾公司；SW-CJ-1D單人單面垂直送風(fēng)（經(jīng)濟(jì)型）凈化工作臺 中國蘇州智凈凈化有限公司；ZHWI-Z11C恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智誠分析儀器制造有限公司；SHP型生化培養(yǎng)箱 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海中安醫(yī)療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 破膜劑的選擇

在96 孔板A04～A12中分別加入100 μL菌液，在A04～A06中分別加入10、50、100 μL 20 g/100 mL SDS溶液，在A07～A09中分別加入10、50、100 μL 20 g/100 mL Triton溶液，在A10～A12中分別加入10、20、40 μL 20 mmol/L麝香草酚溶液，這9 個(gè)孔中不足200 μL的用無菌水補(bǔ)充到200 μL。用VariosKan Flash型多功能酶標(biāo)儀在激發(fā)光為535 nm、發(fā)射光為617 nm波長處測定熒光值。

在以上基礎(chǔ)上，在A04～A12中分別加入0.2 μL 2 mg/mL PI，在激發(fā)光為535 nm、發(fā)射光為617 nm波長處測定熒光值。根據(jù)熒光值分析破膜劑的破膜效果，選擇合適的破膜劑。

1.2.2 麝香草酚最佳破膜濃度選擇

在96 孔板G04～G10中分別加入100 μL菌液，在G04～G10中分別加入0.5、10、20、30、40、60、80 μL 20 mmol/L麝香草酚溶液，這7 個(gè)孔中不足200 μL的用無菌水補(bǔ)充到200 μL。然后每個(gè)孔再加0.2 μL 2 mg/mL PI，用VariosKan Flash型多功能酶標(biāo)儀在激發(fā)光為535 nm、發(fā)射光為617 nm波長處測定熒光值。根據(jù)熒光值分析麝香草酚在不同濃度條件下的破膜效果，選擇最佳的破膜濃度。

1.2.3 染色劑的選擇

在96 孔板F01～F12中分別加入100 μL菌液，在F01～F12中分別加入40 μL 20 mmol/L麝香草酚溶液，這12個(gè)孔中不足200 μL的用無菌水補(bǔ)充到200 μL。然后在F01～F04中分別加0.2 μL 2 mg/mL PI，在F05～F08中分別加0.2 μL 2 mg/mL EB，在F09～F12中分別加0.2 μL 2 mg/mL GoldView，F(xiàn)01～F04在激發(fā)光為535 nm、發(fā)射光為617 nm波長處測定熒光值，F(xiàn)05～F08在激發(fā)光為530 nm、發(fā)射光為590 nm波長處測定熒光值，F(xiàn)09～F12在激發(fā)光為280 nm、發(fā)射光為535 nm波長處測定熒光值。根據(jù)3 種染色劑的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差來選擇最優(yōu)的染色劑。

1.2.4 工作曲線的制作

1.2.4.1 用測定某一菌液菌落數(shù)

采用平板菌落計(jì)數(shù)法，具體操作參照GB/T 4789.2—2008。

1.2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)系列的配制

將1.2.4.1節(jié)所測菌液用無菌水10 倍稀釋，稀釋好的5 個(gè)菌液編號為1、2、3、4、5。

1.2.4.3 工作曲線的繪制

在96 孔板A01～A05中分別加入編號為1～5號的菌液100 μL，在A01～A05中分別加入40 μL 20 mmol/L麝香草酚溶液，60 μL的用無菌水。然后每個(gè)孔再加0.2 μL 2 mg/mL PI，用VariosKan Flash型多功能酶標(biāo)儀在激發(fā)光為535 nm、發(fā)射光為617 nm波長處測定熒光值，繪制菌落總數(shù)的工作曲線。

1.2.5 樣品的測定

采用1.2.4.3節(jié)的方法進(jìn)行測量樣品，測量應(yīng)重復(fù)3 次以上求出平均值，在工作曲線上求出菌落總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 破膜劑的選擇

表1 3 種破膜劑熒光值Table1 Fluorescence values of three membrane-breaking reagents

由表1可知，3 種染色劑自身熒光值最高的是Triton試劑，能達(dá)到0.020 5。由于3 種染色試劑自身熒光值都很小，均在誤差范圍之內(nèi)，因此3 種染色劑自身熒光值均無影響。

由圖1、2可知，SDS作為破膜劑時(shí)，質(zhì)量濃度在10 g/100 mL時(shí)熒光值最大為45.06±1.32；Triton作為破 膜劑時(shí)，質(zhì)量濃度在10 g/100 mL時(shí)熒光值最大為13.76±0.86；麝香草酚作為破膜劑時(shí)，在4 mmol/L時(shí)熒光值最大為62.49±0.84。相比對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，麝香草酚作為破膜劑效果更好。

圖1 SDS/Triton對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響Fig.1 Fluorescence values of SDS/Triton at various concentrations

圖2 麝香草酚濃度對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響Fig.2 Fluorescence values of thymol at various concentrations

2.2 麝香草酚最佳破膜濃度選擇

圖3 麝香草酚不同濃度條件下的熒光值Fig.3 Sel ection of optimal thymol concentration

由圖3可知，麝香草酚作為破膜劑時(shí)，濃度從0.5～4 mmol/L時(shí)熒光值隨著濃度的增大而增大，最大值達(dá)到62.34±1.8；在4 mmol/L以后熒光值趨于穩(wěn)定，基本保持不變。由此可以說明麝香草酚濃度在4 mmol/L時(shí)破膜效果好。

2.3 染色劑的選擇

表2 3 種染色劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 Selection of optimal staining agent

由表2可知，PI作為染色劑時(shí)，在激發(fā)光為535 nm、發(fā)射光為617 nm波長處測定熒光值為62.04，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.08%；EB作為染色劑時(shí)，在激發(fā)光為535 nm、發(fā)射光為617 nm波長處測定熒光值為26.40，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.70%；GoldView作為染色劑時(shí)，在激發(fā)光為535 nm、發(fā)射光為617 nm波長處測定熒光值為124.83，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.23%，由此可知PI是本實(shí)驗(yàn)的最佳染色劑。

2.4 工作曲線的制作

2.4.1 用國標(biāo)法測定某一菌液菌落總數(shù)

將菌液用無菌水稀釋一定的梯度，涂布平板，培養(yǎng)查出菌落總數(shù)（GB/T 4789.2—2008測定方法：平板菌落計(jì) 數(shù)法）。測出菌落總數(shù)為2×1011CFU/mL。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)系列的配制

以已知菌落數(shù)的菌液配制標(biāo)準(zhǔn)系列，見表3。

表3 菌液的標(biāo)準(zhǔn)系列Table3 A series of standard bacterial concentrations

2.4.3 工作曲線的繪制

由1.2.4.3節(jié)的方法繪制工作曲線，得到回歸方程：y=6.778 5x－26.202（R2=0.999 2），線性相關(guān)性較好。

2.5 樣品測定

用1.2.4.3節(jié)的方法，將樣品稀釋100 倍（OD值小于1）后，測出稀釋樣品B. subtilis 168的平均熒光值為19.278，查對標(biāo)準(zhǔn)曲線算出稀釋樣品B. subtilis 168 的菌落總數(shù)為1.03×107CFU /mL，則樣品B. subtilis 168的菌落總數(shù)為1.03×109CFU/mL。

2.6 方法精密度

表4 精密度實(shí)驗(yàn)Table4 Precision of the method

由表4可知，用此方法測定樣品B. subtilis 168菌落數(shù)對應(yīng)熒光值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.29%，方法精密度好。

2.7 回收率

表5 菌落總數(shù)的回收率實(shí)驗(yàn)（n=7）Table5 Recovery of total number of colonies (n=7)

向樣品菌液中加入一定量的菌液，使樣品中菌體總數(shù)增加一定值。在激發(fā)光為535 nm、發(fā)射光為617 nm波長處測定加標(biāo)樣品的熒光值，得相應(yīng)的菌落數(shù)，結(jié)果見表5。實(shí)驗(yàn)重復(fù)7 次結(jié)果可知，菌體的平 均回收率為98.4%，即方法準(zhǔn)確度較高。

2.8 酵母菌和黃曲霉菌菌落總數(shù)

利用熒光標(biāo)記法（上述方法）和平板菌落計(jì)數(shù)法（GB/T 4789.2—2008）測定酵母菌和黃曲霉菌菌落總數(shù)，結(jié)果見表6。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，兩種發(fā)法測出的結(jié)果進(jìn)行比較，酵母菌菌落數(shù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.04%，黃曲霉菌菌落總數(shù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.78%，方法準(zhǔn)確可靠。

表6 酵母菌和黃曲霉菌菌落總數(shù)測定結(jié)果Table6 Determination of the numbers of yeast and Aspergillus flfl avus colonies

3 結(jié) 論

本方法在測定大批量樣品菌落總數(shù)時(shí)，經(jīng)實(shí)際樣品測量，結(jié)果令人滿意。由于本實(shí)驗(yàn)方法在建立好工作曲線后，整個(gè)操作在20 min以內(nèi)能夠完成，且與國標(biāo)法測量結(jié)果一致。熒光標(biāo)記測菌落總數(shù)的方法相比傳統(tǒng)方法相比，大大簡化了操作過程，提高了分析效率，為菌落總數(shù)的測定提供了一種可靠實(shí)用的分析方法。

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Determination of Total Number of Colonies by Fluorescence Labeling Method

ZHANG Yong-shuai, SUN Jun-liang*, LIANG Xin-hong, LI Yuan-zhao
(School of Food Science, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China)

After complete disruption of the microbial cell wall with thymol, the nucleic acids or DNAs were labeled with propidium iodide for the detection of fluorescence values. A standard curve was established for extrapolating total number of colonies based on the fluorescence values. The results showed that the optimal thymol concentration for breaking the microbial cell wall was 4 mmol/L. The relative standard deviation of this method for the determination of the fluorescence of B. subtilis colonies was 1.29%, and the recovery rate was 98.4%. This method is accurate, reliable, simple and rapid without the use of a large amount of plates.

fluorescence labeling; the total number of colonies; thymol

TS235.9

A

1002-6630（2014）20-0131-04

10.7506/spkx1002-6630-201420026

2013-11-04

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（311641/C200101）；河南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（122102110037）

張永帥（1987—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：zys3485@163.com

*通信作者：孫俊良（1964—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)與酶制劑工程。E-mail：sjl338@163.com