食品中芥末過敏原成分LAMP檢測方法的建立

程晉霞，周熙誠，馬 丹，劉 莉，曾 靜,*

（1.北京出入境檢驗檢疫局，北京 100026；2.北京農(nóng)學(xué)院，北京 102206）

食品中芥末過敏原成分LAMP檢測方法的建立

程晉霞1,2，周熙誠1，馬 丹1，劉 莉1，曾 靜1,*

（1.北京出入境檢驗檢疫局，北京 100026；2.北京農(nóng)學(xué)院，北京 102206）

目的：建立食品過敏原芥末成分環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）檢測方法，并與實時熒光-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測方法比對。方法：針對白芥的主要過敏原基因Sin A1，設(shè)計LAMP引物并建立反應(yīng)體系，在特異性和靈敏度方面與RT-PCR檢測方法比對。結(jié)果：建立的LAMP檢測方法，經(jīng)特異性驗證，與所測試的13 種植物，無交叉反應(yīng)。通過添加實驗，方法的檢測靈敏度為0.5%，與RT-PCR方法檢測靈敏度相當(dāng)。檢測了25 份實際樣品，檢測結(jié)果與RT-PCR檢測結(jié)果一致。結(jié)論：建立的食品過敏原芥末成分LAMP檢測方法簡單經(jīng)濟(jì)，檢測結(jié)果可靠，可有效縮短檢測時間，適用于芥末過敏原成分的檢測，具有良好的應(yīng)用前景。

芥末；過敏原；環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增；實時熒光-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

過敏性疾病發(fā)病率呈逐年上升趨勢，已成為重要的食品安全問題。據(jù)文獻(xiàn)報道40%的兒童被診斷出在某種程度上患有過敏性疾病，1990—2000年在英國和愛爾蘭有8 人死于此病。發(fā)達(dá)國家超過20%的人受過敏性疾病的困擾[1]，而且食物過敏目前只能預(yù)防，不能治愈[2]。芥末是常見的過敏原之一。芥末屬于被子植物門，十字花科植物。芥末種子及其粉末在世界各地被廣泛地用作調(diào)味料來使用。芥末中的致敏物質(zhì)主要是一種由二硫鍵連接的重鏈和輕鏈組成的蛋白，它耐高溫和消化酶的作用，從而使其在加工過程中不易受影響，而且在加工過程中，致敏蛋白很可能被某些成分隱藏，從而增加檢測的難度。芥末致敏可引起過敏性皮膚炎、神經(jīng)性水腫、支氣管哮喘等疾病，成人和兒童都可能發(fā)病[3]。迄今，食品過敏原性的主要檢測方法有皮膚實驗、雙盲安慰劑對照激發(fā)實驗、血清IgE檢測和組胺釋放實驗等；國內(nèi)外學(xué)者近幾年在不斷研究建立食品中致敏原成分的快速有效檢測方法。Mustorp[4]、邵娟[5]等采用實時熒光-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）方法檢測食品中的芥末成分，Lee等[6]運用雙抗體夾心法檢測了沙拉和灌腸中殘留的芥末。

近年來，隨著核酸快速檢測技術(shù)的研究發(fā)展，普通PCR及RT-PCR等快速、特異方法被引入食品過敏原成分的檢驗[7-9]，但這類方法均需要特殊儀器，不適于在廣大基層實驗室實施開展，使其應(yīng)用受到了極大的限制。直至近年來出現(xiàn)的 LAMP方法[10]，具有簡單、特異、快速、靈敏等優(yōu)點，尤其適合在基層實驗室應(yīng)用與開展。已有報道采用LAMP方法檢測過敏原大豆、花生等成分[11-12]。本實驗采用通過熒光信號判斷LAMP反應(yīng)的技術(shù)和設(shè)備，建立芥末過敏原成分LAMP檢測方法，并與RT-PCR方法比對，旨在建立切實可行的芥末過敏原成分LAMP檢測技術(shù)，檢測時間只需45～60 min即可。通過這一檢測方法的建立，有助于解決我國食品安全中的過敏問題，有助于為預(yù)防芥末食品過敏的發(fā)生提供預(yù)警技術(shù)手段，保障人民群眾的身體健康，有利于促進(jìn)我國芥末食品國際貿(mào)易，并為規(guī)范我國食品過敏原標(biāo)簽管理提供一定的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

實驗樣品包括芥末、小米、芝麻、花生、青豆、芹菜、麥片、玉米、紅豆、杏仁、核桃、大米、土豆和5 類市售樣品（調(diào)料類、小食品類、蔬菜類、農(nóng)作物類、堅果類）均為市購。

甜菜堿（5 mol/L） 美國Sigma公司；dNTP（10 mmol/L） 上海生工生物工程有限公司；MgSO4（50 mmol/L） 北京索萊寶科技有限公司；Bst DNA聚合酶（8 U/μL）、10×ThermoPol緩沖液（1×ThermoPol緩沖液含0.1% TritonX-100、10 mmol/L (NH4)2SO4、10 mmol/L KCl、20 mmol/L Tris-HCl） 美國NEB公司；鈣黃綠素?zé)晒馊玖?廣州迪澳生物技術(shù)有限公司；TaqMan Gene Expression Master Mix（2×） 美國Life公司；十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）提取液：100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），20 mmol/L Na2EDTA，1.4 mol/L NaCl，20 g/L CTAB；CTAB沉淀液：5 g/L CTAB，40 mmol/L NaCl；1×TE緩沖液 生工生物工程（上海）股份有限公司；三氯甲烷 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白酶K（20 mg/mL） 天根生化科技有限公司；10×PBS緩沖溶液（NaCl 80 g、NaHPO4×12H2O 29 g、KCl 2 g、KH2PO42 g、先溶于900 mL去離子水，待充分溶解后再加去離子水至1 L，室溫保存）使用時進(jìn)行1∶10稀釋；DL 2000 DNA Marker 日本TakaRa公司。

LAMP擴(kuò)增儀 德國Qiagen公司；7900實時熒光定量PCR儀 美國Life公司；凝膠電泳成像儀 美國Bio-Rad公司；恒溫加熱塊、微量移液器（10、100、200、1 000 μL） 德國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取

芥末DNA提取方法主要參考王瑋[13]、Scaravelli[14]等的方法，即CTAB法，稍作修改，具體步驟如下：稱取200 mg樣品于2 mL離心管中，加入1.5 mL CTAB提取緩沖液和10 μL 20 mg/mL蛋白酶K溶液，60 ℃振蕩孵育過夜。將上述裂解物于12 000×g 離心10 min，小心轉(zhuǎn)移上清液至新的2 mL 離心管中；加入750 μL三氯甲烷后用力振蕩，12 000×g 離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的2 mL 離心管中；加入2 倍體積的CTAB沉淀液，室溫靜置1 h 后，12 000×g 離心15 min，棄去上清液；加入350 μL 1.2 mol/L NaCl溶液將沉淀充分懸浮，再加入350 μL三氯甲烷，渦旋振蕩混勻，12 000×g離心10 min；小心轉(zhuǎn)移上清液至新的1.5 mL 離心管中后加入0.8 倍體積異丙醇，－20 ℃靜置1 h，12 000×g離心10 min，棄去上清液；用70%乙醇溶液洗滌沉淀2～3次后，12 000×g離心10 min，小心傾倒乙醇，沉淀揮發(fā)干燥，加100 μL TE溶液溶解沉淀DNA，立即使用或－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 LAMP方法

1.2.2.1 LAMP引物設(shè)計

引物設(shè)計靶基因選擇白芥管家基因Sin A1基因[5,13]（GenBank No.S54101）。應(yīng)用引物設(shè)計軟件PrimerExplorer 4.0設(shè)計的引物序列包括：外側(cè)上游引物F3（5’-CCGGCCCATTTAGGATTCC-3’）、外側(cè)下游引物B3（5’- ACTGCTGGAGTAGTGGTGG 3’）、內(nèi)側(cè)上游引物FIP（5’-CTGCATTGCCTGCTT GTGGAGGTTTCAGCAAGCACAACACC-3’）、內(nèi)側(cè)下游引物BIP（5’-CCGGTAGTGGTCCAAGCTGG ATCTGCTGTGGTCCCTGTG-3’）、環(huán)狀上游引物L(fēng)F（5’-CCATTGTTGGCAAGCTCTCA-3’）、環(huán)狀下游引物L(fēng)B（5’-CCCTCGACGATGAGTTTGATTT -3’）。

1.2.2.2 LAMP 檢測體系初步建立

配制反應(yīng)體系25 μL，包括：MgSO4、dNTPs、甜菜堿、內(nèi)引物、外引物、環(huán)引物、Bst DNA聚合酶、1×ThermoPol緩沖液以及適量的DNA模板；混勻，于65 ℃溫育60 min。

1.2.2.3 反應(yīng)體系的優(yōu)化

選擇Mg2+、dNTPs和甜菜堿這幾個參數(shù)，進(jìn)行反應(yīng)體系的優(yōu)化。Mg2+濃度選擇2、4、6、8、10 mmol/L，dNTPs濃度選擇1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 mmol/L、甜菜堿濃度選擇0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol/L，進(jìn)行LAMP反應(yīng)，于65 ℃溫育60 min，反應(yīng)結(jié)束后電泳觀察擴(kuò)增效果，確定最佳反應(yīng)體系。

1.2.2.4 結(jié)果判定

實時熒光曲線變化：若有“S”型擴(kuò)增曲線且擴(kuò)增值超過設(shè)定的閾值為陽性（有核酸擴(kuò)增），若擴(kuò)增曲線的擴(kuò)增值未超過設(shè)定的閾值為陰性（無核酸擴(kuò)增）。

電泳檢測：LAMP法的擴(kuò)增產(chǎn)物是各種不同長度的莖-環(huán)狀結(jié)構(gòu)DNA，因此陽性反應(yīng)通過2%瓊脂糖電泳檢測呈梯形條帶，而陰性反應(yīng)則沒有梯形擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，可作為輔助檢測方法。

1.2.3 RT-PCR方法

1.2.3.1 RT-PCR引物設(shè)計

同樣選擇白芥管家基因Sin A1基因，應(yīng)用引物設(shè)計軟件Primer Express 3.0設(shè)計引物序列包括：上游引物P1（5’-CACCTGAGAGCTTGCCAACA -3’）、下游引物P2（5’-GACCACTACCGGACTGCATTG-3’）、探針P（5’-FAM-TGGCTCCACAAGCAG -TAMRA-3’）。

1.2.3.2 RT-PCR反應(yīng)體系

25 μL反應(yīng)體系中包括2×TaqMan Gene Expression Master Mix 12.5 μL；其他成分終濃度依次為上游引物P1、下游引物P2各0.4 μmol/L，探針P為0.2 μmol/L；D N A模板3 μ L；其余體系用焦磷酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）水補(bǔ)足。反應(yīng)程序為：第一步，預(yù)變性進(jìn)行一個循環(huán)，95 ℃、10 min；第二步，PCR反應(yīng)，進(jìn)行40個循環(huán)，95 ℃變性15 s；后60 ℃延伸1 min，設(shè)DEPC水為陰性對照。

1.2.3.3 結(jié)果判定

在陰性對照無Ct值顯示或Ct值為40，且陽性對照的Ct值不大于30的前提下判斷此次實驗有效，若檢測樣本Ct值不大于35，判斷為陽性，否則判斷為陰性。

1.2.4 LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測

取2 μL擴(kuò)增產(chǎn)物和0.4 μL上樣緩沖液混勻點樣于含0.8 μg/L溴化乙錠的2%～3%瓊脂糖凝膠中，電壓150 V約20～30 min后置于凝膠成像系統(tǒng)中成像，電泳圖片顯示LAMP特征性梯狀條帶為陽性，無任何條帶為陰性。

1.2.5 特異性實驗

采用本方法所建立的LAMP和RT-PCR檢測方法對芥末、小米、芝麻、花生、青豆、芹菜、麥片、玉米、紅豆、杏仁、核桃、大米、土豆共13 種植物進(jìn)行檢測，并對結(jié)果進(jìn)行判斷，比較兩種檢測方法的特異性。

1.2.6 靈敏度實驗

取不含芥末成分的玉米粉為基質(zhì)樣品，進(jìn)行人工添加實驗，添加水平分別為0.1%、0.5%、1%和2%。按1.2.1節(jié)中提供的核酸提取方法提取核酸，用純芥末核酸作為陽性對照模板，DEPC水作為陰性對照模板，然后分別用LAMP方法和RT-PCR方法進(jìn)行檢測。

1.2.7 實際食品樣品的檢測

采購5 類市售樣品包括調(diào)料類、小食品類、蔬菜類、農(nóng)作物類、堅果類，總共25 份樣品。采用本實驗所建立的LAMP和RT-PCR檢測方法對其進(jìn)行檢測，并對結(jié)果進(jìn)行判斷。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)體系的優(yōu)化

通過對LAMP反應(yīng)體系中的Mg2+、dNTPs和甜菜堿進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mg2+濃度在4～8 mmol/L的范圍內(nèi)對檢測效果沒有明顯影響，可以獲得較強(qiáng)的擴(kuò)增效率，選用4 mmol/L（圖1）；dNTPs濃度在1.4～2.2 mmol/L范圍內(nèi)所得的檢測效果沒有明顯差異，選用1.4 mmol/L（圖2）；甜菜堿濃度對反應(yīng)體系影響不大（圖3），在選0.8 mol/L條件下，反應(yīng)體系更穩(wěn)定，于65 ℃反應(yīng)60 min時所得效果最佳，故此作為本研究所推薦的反應(yīng)體系。

圖1 Mg2+濃度對LAMP反應(yīng)的影響Fig.1 Effect of Mg2+concentration on the LAMP reaction

圖2 dNTPs濃度對LAMP反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of dNTPs concentration on the LAMP reaction

圖3 甜菜堿濃度對LAMP反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of betaine concentration on the LAMP reaction

2.2 檢測特異性

采用本實驗所建立的LAMP和RT-PCR檢測方法對芥末、小米、芝麻、花生、青豆、芹菜、麥片、玉米、紅豆、杏仁、核桃、大米和土豆共13 種植物進(jìn)行檢測，結(jié)果見表1。該結(jié)果表明本研究所建立的LAMP檢測方法具有良好的特異性，該結(jié)果與RT-PCR結(jié)果相同。LAMP檢測圖譜見圖4A，RT-PCR檢測圖譜見圖4B。

表1 LAMP與RT-PCR檢測特異性Table1 Specificity of LAMP and RT-PCR

圖4 LAMP（A）和RT-PCR（B）特異性實驗結(jié)果Fig.4 Amplification curves showing the specificity of LAMP (A) and RT-RT-PCR (B)

2.3 檢測靈敏度

取不含芥末成分的玉米粉為基質(zhì)樣品，進(jìn)行人工添加實驗，添加水平分別為0.1%、0.5%、1%和2%。分別用LAMP方法和RT-PCR方法進(jìn)行靈敏度檢測，檢測結(jié)果見圖5。該結(jié)果表明，LAMP檢測方法與RT-PCR檢測方法具有相同的檢測靈敏度，均達(dá)到0.5%。

圖5 LAMP（A）和RT-PCR（B）靈敏度實驗結(jié)果Fig.5 Sensitivity of LAMP (A) andRT-PCR (B)

2.4 實際食品樣品的檢測

表2 實際樣品檢測結(jié)果Table2 LAMP and PCR results for real samples

購買不同種類的實際樣品進(jìn)行LAMP、RT-PCR兩種方法的檢測，檢測結(jié)果如表2所示。5 類食品樣品包括調(diào)料類、小食品類、蔬菜類、農(nóng)作物類、堅果類，總共25 份樣品，兩種檢測方法的檢測結(jié)果一致，均與樣品標(biāo)示相符，準(zhǔn)確率達(dá)到100%。

3 討 論

食物過敏已成為重要的食品安全問題[15-17]。芥末是常見的食品過敏原之一。本研究根據(jù)白芥管家基因Sin A1基因設(shè)計6 條LAMP引物，優(yōu)化并建立了LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。在反應(yīng)體系中加入含有MnCl2的鈣黃綠素?zé)晒馊玖?，反?yīng)結(jié)果可在白光下肉眼觀察否產(chǎn)生綠色鈣錳復(fù)合物來判斷靶基因存在與否，亦可通過LAMP實時熒光信號直接判定結(jié)果。

采用本實驗所建立的LAMP和RT-PCR檢測方法對芥末、小米、芝麻、花生、青豆、芹菜、麥片、玉米、紅豆、杏仁、核桃、大米和土豆共13 種植物進(jìn)行檢測，結(jié)果表明本研究所建立的LAMP檢測方法具有良好的特異性，該結(jié)果與RT-PCR結(jié)果相同。芥末在世界各地被廣泛地用作調(diào)味料來使用，按種子的顏色又分為白芥末、棕芥末和黑芥末，為了進(jìn)一步驗證芥末LAMP引物的特異性，對白芥、棕芥、黑芥多份樣品進(jìn)行了特異性驗證，發(fā)現(xiàn)均有擴(kuò)增。表明其特異性良好。在靈敏度實驗中，取不含芥末成分的玉米粉為基質(zhì)樣品，進(jìn)行人工添加實驗，添加水平分別為0.1%、0.5%、1%和2%。分別用LAMP方法和RT-PCR方法進(jìn)行靈敏度檢測，結(jié)果表明，LAMP檢測方法與RT-PCR檢測方法具有相同的檢測靈敏度，均達(dá)到0.5%。為了進(jìn)一步驗證本研究建立的過敏原芥末LAMP檢測方法的應(yīng)用性，對5 類食品樣品包括調(diào)料類、小食品類、蔬菜類、農(nóng)作物類、堅果類，共25 份實際樣品進(jìn)行檢測，其檢測結(jié)果與實時熒光PCR檢測結(jié)果一致，均與樣品標(biāo)示相符，準(zhǔn)確率達(dá)100%?？傊狙芯拷⒌氖称愤^敏原芥末成分LAMP檢測方法簡單經(jīng)濟(jì)，檢測結(jié)果可靠，可有效縮短檢測時間，適用于芥末過敏原成分的檢測，具有良好的應(yīng)用前景。但LAMP 是近年來興起的一種新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)，所以必然伴隨著某些不足：LAMP法只能有兩種結(jié)果：擴(kuò)增和不擴(kuò)增。靶序列長度控制在300 bp以下，一旦產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，則不易鑒別。這些都無法同PCR媲美，故改進(jìn)和完善LAMP必將成為科研人員的新目標(biāo)。

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Establishment of a Loop-Mediated Isothermal Amplification Method for Detection of Mustard Allergen in Foods

CHENG Jin-xia1,2, ZHOU Xi-cheng1, MA Dan1, LIU Li1, ZENG Jing1,*
(1. Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Beijing 100026, China; 2. Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China)

Objective: A loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method was established for the detection of mustard allergen in foods and was compared with real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). Methods: The Sin A1 gene of Sinapis alba was used to design LAMP primers. The specificity and sensitivity of LAMP were compared with those of RT-PCR. Results: The specificity of LAMP method was tested with 13 different crops. The results showed that the LAMP method was highly specific to mustard. No cross-reaction was found. The limit of detection (LOD) for LAMP was 0.5% in base-material addition test, which was consistent with that of the RT-PCR method. For 25 real food samples, the LAMP results were consistent with the RT-PCR results. Conclusion: The LAMP method of established in this study was simple, economical and reliable and could effectively reduce the detection time.

mustard; allergen; loop-mediated isothermal amplification (LAMP); real-time polymerase chain reaction (RT-PCR)

TS207.3

A

1002-6630（2014）20-0148-05

10.7506/spkx1002-6630-201420030

2013-10-31

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2011BAK10B03）

程晉霞（1988—），女，碩士研究生，研究方向為食品安全與控制。E-mail：cjx19881031@sina.cn

*通信作者：曾靜（1963—），女，研究員，博士，研究方向為食品安全檢測。E-mail：zengj@bjciq.gov.cn