許加軍，楊洪安，王國棟

(山東大學附屬省立醫(yī)院，濟南250021)

膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)有保護多巴胺能神經(jīng)元和修復其損傷的作用［1～3］，保護作用通常發(fā)生在損傷即刻，持續(xù)數(shù)小時，而修復作用通常在傷后數(shù)天至數(shù)周才表現(xiàn)出來，并持續(xù)較長時間。如在神經(jīng)元損傷后數(shù)小時內或損傷前預防給藥，以保護作用為主;如給藥覆蓋帕金森病整個病程，則以修復作用為主。2013年10～12月，我們向帕金森病模型大鼠腦室或殼核內直接注射GDNF，觀察其對大鼠黑質紋狀體系統(tǒng)多巴胺能神經(jīng)元的修復作用?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物模型的制備 健康雄性SD70大鼠，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。常規(guī)飼養(yǎng)，自由進食水。2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，固定于立體定向儀。以前囟為標準參考點，參照大鼠腦立體定位圖譜，于右側前腦內側束(MFB，A/P:－ 3.6 mm;L:+2.0 mm;V:－ 9.0 mm)及腹側被蓋區(qū)(VTA，A/P:－6.0 mm;L:+0.5 mm;V:－8.0 mm)分別立體定向注入12 μg 6-OHDA(3 μg/μL)，注射速度為 1 μL/min，經(jīng) 2周的跟蹤監(jiān)測，獲得39只穩(wěn)定對側旋轉的帕金森病模型［4］。腹腔麻醉下應用立體定向技術分別在20只大鼠右側腦室近紋狀體側和19只大鼠雙側殼核中央部放置微型導管(外徑0.5 mm)。導管通過一段軟管接于埋于側腹部皮下的緩釋泵［5］。無論是單側腦室置管還是雙側殼核置管，GDNF均能作用于雙側腦區(qū)。

1.2 GDNF給藥方法 術后1周內所有造模成功大鼠每日通過導管輸注賦形劑(10 mmol/L枸櫞酸鹽、150 mmmol/L NaCl緩沖液)。術后2～3周，15只大鼠(觀察A組)腦室內注射人重組GDNF，7.5 μg/d;14只(觀察B組)殼核內注射人重組GDNF，7.5 μg/d;5只(對照 A 組)腦室內注射賦形劑，5只(對照B組)殼核內注射賦形劑至實驗結束。

1.3 黑質酪氨酸羥化酶陽性(TH+)多巴胺能神經(jīng)元大小、數(shù)量及紋狀體TH+神經(jīng)纖維密度測算 所有動物麻醉后，心內注射肝素化冰生理鹽水，然后取其腦組織置于冰腦模上行冠狀切片，層厚為1 mm。在包含尾狀核、殼核、伏隔核的層面行雙側腦組織打孔取標本。將該層面每側紋狀體按照距離腦室遠近分為內側部、中間部和外側部三個區(qū)域分別進行標本采集。

4℃下，把紋狀體冠狀切片標本以及整個中腦組織均放在4%的甲醛中固定，然后用滑動切片機切片，取包含黑質、紋狀體層面行TH免疫組化染色，光鏡下觀察。操作按試劑盒說明書進行。采用光學分餾方法對中腦組織多巴胺能神經(jīng)元進行無偏立體細胞計數(shù)，獲得TH+神經(jīng)元數(shù)目以及大小(被蓋腹側區(qū)域不計入興趣區(qū)域)。計數(shù)雙側紋狀體TH+神經(jīng)纖維密度，以側腦室作為參考點，用1.2 mm×1.2 mm柵格從背到腹計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)用±s表示。組間比較采用t檢驗和方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

各組大鼠中腦組織黑質TH+多巴胺能神經(jīng)元大小和數(shù)目見表1，紋狀體內側部TH+神經(jīng)纖維密度見表2。由表1、表2可見，對照A、B組大鼠右側中腦組織黑質TH+多巴胺能神經(jīng)元大小和數(shù)目及紋狀體內側部TH+神經(jīng)纖維密度均較左側降低，P均＜0.05。觀察A組與對照A組相比、觀察B組與對照B組相比，雙側中腦組織黑質TH+多巴胺能神經(jīng)元大小和數(shù)目及紋狀體內側部TH+神經(jīng)纖維密度均明顯升高，P均＜0.05。

表1 各組大鼠中腦組織黑質TH+多巴胺能神經(jīng)元大小和數(shù)目比較(±s)

表1 各組大鼠中腦組織黑質TH+多巴胺能神經(jīng)元大小和數(shù)目比較(±s)

注:與對照 A組相比，*P ＜0.05;與對照 B 組相比，#P ＜0.05

組別 n 神經(jīng)元數(shù)目(個/HP)左側 右側神經(jīng)元大小(μm2)左側 右側觀察A組 15 242 325±11 053*51 300±13 862* 392±47* 309±33*觀察B組 14 270 675±10 126 67 500±11 622 472±25 302±22對照A組 5 194 400±11 086 32 400±1788 303±25 231±9對照B組 5 204 930±12 367#35 370±1 986# 309±40# 232±14#

表2 各組大鼠紋狀體內側部TH+神經(jīng)纖維密度比較(±s)

表2 各組大鼠紋狀體內側部TH+神經(jīng)纖維密度比較(±s)

注:與對照 A 組相比，*P ＜0.05;與對照 B 組相比，#P ＜0.05

組別 n TH+神經(jīng)纖維密度(條/HP)左側 右側觀察 A 組 15 93.4 ±1.1* 6.4 ±7.3*觀察 B 組 14 91.7 ±0.2# 14.6 ±3.6#對照 A 組 5 91.5 ±1.8 2.8 ±0.6對照B組5 79.0 ±2.0 6.8 ±0.9

3 討論

本研究結果顯示向帕金森大鼠腦室或紋狀體內輸注GNDF對黑質紋狀體系統(tǒng)多巴胺能神經(jīng)元具有顯著性修復作用，可增加腦組織黑質TH+多巴胺能神經(jīng)元大小和數(shù)目及紋狀體內側部TH+神經(jīng)纖維密度，改善黑質紋狀體系統(tǒng)功能。金美芳等［1］采用慢病毒作載體，使GDNF基因在PD模型黑質紋狀體部位持續(xù)表達，結果與本研究大體相同，但其轉染GDNF基因是實驗損毀1周后進行，主要強調GDNF對黑質紋狀體的保護功能。另外在其研究中，腦內GDNF給藥劑量無法控制，不能長期監(jiān)測。本研究中GDNF給藥始于損毀后2周，避開了GDNF保護作用有效期［6］，明確觀察GDNF對多巴胺能神經(jīng)元顯著修復作用。

本研究結果顯示殼核或者腦室內注射均可以收到良好的神經(jīng)元修復效果，這與既往研究［7］結論一致。GDNF對殘存多巴胺神經(jīng)纖維具有顯著修復作用，這與文獻［8］結論一致。對照組近腦室側紋狀體TH+神經(jīng)纖維密度最高，說明殘存纖維主要集中在近腦室紋狀體，而在實驗組，纖維再生和修復最明顯也發(fā)生在近腦室紋狀體，說明GDNF神經(jīng)修復作用主要作用對象為損毀后殘存神經(jīng)纖維，這正是GDNF能夠上調黑質紋狀體系統(tǒng)多巴胺能神經(jīng)元活性主要機制。

本研究結果顯示，腦室內或殼核內輸注GDNF不但能修復損毀側黑質神經(jīng)元，還能顯著增加健側黑質神經(jīng)元數(shù)目，這與文獻［9］結果相同。故認為腦室內或殼核內注射GDNF可以通過擴散逆向運輸在黑質等鄰近腦區(qū)廣泛分布［10］。目前有證據(jù)表明帕金森動物模型中黑質神經(jīng)元調亡前會出現(xiàn)多巴胺表型丟失，從而造成這些神經(jīng)元活性喪失［11］(即這些細胞并不表達TH)，這可以作為GDNF發(fā)揮作用的靶細胞。目前有證據(jù)表明在成年動物新皮層、紋狀體和黑質等部分腦區(qū)均存在神經(jīng)再生［12］。所以GDNF也可能通過促進神經(jīng)再生途徑對黑質紋狀體細胞進行修復。

［1］金美芳，李潔.PD模型中GDNF與星形膠質瘤對黑質DA能神經(jīng)元的影響［J］.中國實用神經(jīng)疾病雜志，2008，11(6):8-10.

［2］Xiao CH，Wang YQ，Liu HW，et al.Intrastriatal glial cell line-derived neurotrophic factors for protecting dopaminergic neurons in the substantia nigra of mice with Parkinson disease［J］.Neu Reg Res，2007，2(4):207-210.

［3］Burke RE.GDNF as a candidate striatal target-derived neurotrophic factor for the development of substantia nigra dopamine neurons［J］.J Neural Transm Suppl，2006，(70):41-45.

［4］鄧興力，雷德強，劉如恩，等.帕金森病大鼠模型的建立［J］.廣東醫(yī)學，2012，33(3):313-315.

［5］Inoue K.The mechanism and control of neuropathic pain［J］.Rinsho Shinkeigaku，2009，49(11):779-782.

［6］Dietz GP，Valbuena PC，Dietz B，et al.Application of a bloodbrain-barrier-penetrating form of GDNF in a mouse model for Parkinsin's disease［J］.Brain Res，2006，1082(1):61-66.

［7］Kirik D，Rosenblad C，Bjorklund A，et al.Long-term rAAV mediated gene transfer of GDNF in the rat Parkinson＇s model:intrastriatal but not intranigral transduction promotes functional regeneration in the lesioned nigrostriatal system［J］.J Neurosci，2000，20(3):4686-4700.

［8］Zhang Y，Zhu W，Wang YG，et al.Interaction of SH2-Bbeta with RET is involved in signaling of GDNF-induced neurite outgrowth［J］.J Cell Sci，2006，119(8):1666-1676.

［9］劉洪梅，余景考，丁艷霞，等.GDNF激活星形膠質細胞保護PD模型大鼠黑質多巴胺能神經(jīng)元［J］.神經(jīng)解剖學雜志，2006，22(4):367-372.

［10］Buytaert-Hoefen KA，Alvarez E，F(xiàn)reed CR.Generation of tyrosine hydroxylase positive neurons from human embryonic stem cells after coculture with cellular substrates and exposure to GDNF［J］.Stem Cells，2004，22(5):669-674.

［11］Fornai F，Schluter OM，Lenzi P，et al.Parkinson-like syndrome induced by continuous MPTP infusion:convergent roles of the ubiquitin-proteasome system and alpha-synuclein［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(9):3413-3418.

［12］Gould E，Gross CG.Neurogenesis in adult mammals:some progress and problems［J］.J Neurosci，2002，22(3):619-623.