劉彥魁，游慶軍，金琳芳，馮靜潔，齊曉薇

(無錫市第四人民醫(yī)院，江蘇無錫214062)

淋巴轉移是結直腸癌轉移的主要方式。瘤細胞浸入淋巴管后，隨淋巴流首先到達局部引流淋巴結，之后聚集于邊緣竇，繼續(xù)增殖累及整個淋巴結。結直腸癌伴淋巴轉移者預后明顯不良，且對放化療敏感性低［1～3］。CXCL13是趨化因子 CXC 家族的一員，主要分布在人體肝臟、淋巴結和血清中，其編碼基因定位于 4q21［4，5］。CXCL13 能夠吸附 B 細胞，并參與免疫系統(tǒng)信號的傳遞。CXCL13與其受體CXCR5共同作用發(fā)揮生物學效應，后者主要分布在成熟B細胞上，參與免疫功能微環(huán)境的構建，具有協(xié)調體液免疫的功能。最近研究表明，CXCL13及其受體CXCR5的表達與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有緊密的關系［6，7］。KRAS基因是結直腸癌的重要相關基因，已有分子靶向藥物絡氨酸激酶抑制劑用于臨床。結直腸癌組織中CXCL13表達是否與KRAS基因有關尚不清楚。2013年1～11月，我們觀察了CXCL13及其受體CXCR5對結直腸癌淋巴轉移的影響，并探討其與KRAS基因突變的關系?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 97例結直腸癌原發(fā)灶標本(觀察A組)和51例轉移灶標本(觀察B組)為2007～2009年間無錫市第四人民醫(yī)院手術切除標本，經(jīng)病理檢查確診;52例正常結直腸標本(對照A組)和43例正常淋巴結標本(對照B組)為2011～2012年該院手術切除標本，經(jīng)病理診斷為癌癥陰性者。觀察組結直腸癌患者中男63例，女85例;對照組男45例，女50例。兩組入選標本所涉及患者年齡36～77歲，中位年齡49歲。本研究涉及患者標本采集前均簽署知情同意書，手術前均未接受放化療及其他特殊藥物治療。觀察組結腸癌84例，直腸癌64例;管狀腺癌58例，乳頭狀腺癌52例，黏液癌31例，未分化癌7例。隨訪?個月，失訪11例，死亡41例，意外死亡4例。

1.2 CXCL13和CXCR5表達檢測及結果判定方法采用免疫組化法。CXCR5和CXCL13鼠抗人抗體購自美國R＆D Systems公司，DAB顯色劑購自基因科技上海有限公司。標本采集后立即浸入10%中性甲醛液中固定12 h，經(jīng)病理醫(yī)生取材后、脫水、透明、包埋，4 μm切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇除去二甲苯，高壓鍋修復，3%的正常羊血清封閉特異性位點20 min，接著用一抗孵育1 h，二抗孵育30 min，最后用DAB顯色。免疫組化結果由兩名副主任以上職稱醫(yī)師判讀得出。細胞膜和(或)細胞質出現(xiàn)棕褐色為CXCR5或CXCL13陽性。按著色強度評分:無著色得0分，弱陽性得1分，中等強度陽性得2分，強陽性得3分。按陽性細胞比例評分:無細胞著色得0分，陽性細胞比例1%～9%得0.1分，陽性細胞比例10%～49%的0.5分，陽性細胞比例大于50%得1分。最終結果H評分為著色強度評分和陽性細胞比例得分的乘積［6］。

1.3 KRAS基因突變情況檢測方法 KRAS基因突變檢測試劑盒購自廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司。首先用FFPE DNA提取試劑盒提取石蠟包埋的原發(fā)灶或者轉移灶標本的DNA，然后采用Real Time PCR法檢測人類KRAS基因的突變，包括12和13密碼子上7種熱點體細胞的突變，分別為:Gly12Asp、Gly12Ala、Gly12Val、Gly12Ser、Gly12Arg、Gly12Cys、Gly13Asp。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料的集中趨勢與離散趨勢以±s表示。各臨床病理參數(shù)與CXCL13和CXCR5表達的相關性分析采用四格表χ2或R×C列表χ2分析;組間生存分析數(shù)據(jù)的比較應用Kaplan-Meier's分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CXCL13及CXCR5表達 CXCL13主要表達于間質細胞，觀察A組陽性表達率為36.08%，觀察B組47.06%，對照A組0，對照 B組11.63%。CXCL13陽性表達率觀察B組＞觀察A組＞對照B組＞對照A組，P均＜0.05。CXCR5主要表達于上皮細胞，觀察 A組陽性表達率 41.24%，觀察 B組49.01%，對照A組0，對照B組9.30%。CXCR5陽性表達率觀察B組＞觀察A組＞對照B組＞對照A組，P均＜0.05。觀察組CXCL13與CXCR5表達水平有相關性(P＜0.05)。

2.2 CXCL13及CXCR5蛋白表達與臨床病理參數(shù)的關系 觀察組CXCL13及CXCR5蛋白表達與TNM分期呈正相關(P＜0.05)，與分化程度呈負相關(P＜0.05)，與患者的性別、年齡、腫瘤大小及腫瘤組織學分類等無明顯相關(P均＞0.05)。詳見表1。

表1 觀察組CXCL13及CXCR5蛋白陽性表達與臨床病理參數(shù)的關系

2.3 CXCL13及CXCR5蛋白表達與結直腸癌預后的關系 觀察B組CXCL13表達陽性者5年無進展中位生存時間(PFS)為(9.0±2.3)個月，陰性者為(12.0±7.3)個月，P ＜0.05;CXCR5表達陽性者5 年PFS為(11.4 ±5.4)個月，陰性者為(25.5 ±9.3)個月，P＜0.05。觀察A組CXCL13表達陽性者5年PFS為(25.0 ±11.3)個月，陰性者(37.0 ±16.5)個月，P＜0.05;CXCR5表達陽性者5年PFS為(21.7±4.8)個月，陰性者為(55.0 ±17.5)個月，P ＜0.05。

2.4 CXCL13及CXCR5蛋白表達與KRAS基因突變的關系 觀察A組KRAS基因突變型36例(其中CXCL13表達陽性12例、CXCR5表達陽性17例)，野生型61例(其中CXCL13表達陽性23例、CXCR5表達陽性23例)，CXCL13及CXCR5蛋白表達與KRAS基因是否發(fā)生突變均有相關性(P均＜0.05)。觀察B組KRAS基因突變型20例(其中CXCL13表達陽性16例、CXCR5表達陽性14例)，野生型31例(其中CXCL13表達陽性8例、CXCR5表達陽性11例)，CXCL13及CXCR5蛋白表達與KRAS基因是否發(fā)生突變均有相關性(P均＜0.05)。

3 討論

結直腸癌是我國常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于胃癌和食管癌，居腫瘤發(fā)病率的第5位，且近年有逐漸增加的趨勢［8，9］。結直腸癌的轉移常作為評價預后的重要指標，轉移的程度對治療策略的選擇也有重要的意義。結直腸癌的轉移以淋巴結轉移為主，結腸癌在結腸上、旁、中間和終末四組淋巴結均有轉移;直腸癌首先轉移至直腸旁淋巴結，然后再擴散，浸及直腸及肛周組織［3，10］。近年發(fā)現(xiàn)一系列與結直腸癌發(fā)生、發(fā)展及轉移有重要關系的小分子調節(jié)蛋白，趨化因子就是其中重要的一類。趨化因子通過與其受體相互作用發(fā)揮重要的生物學功能。

趨化因子主要有C、CC、CXC、CX3C四個家族，其主要與機體的免疫系統(tǒng)相關。最早發(fā)現(xiàn)其與HIV病毒感染的機制有一定的關系［11，12］。近年研究發(fā)現(xiàn)，其與多種腫瘤的進展有一定的關系，尤其是CXCL13及其受體蛋白CXCR5的表達。CXCL13是CXC家族的一種，研究者最先在肝臟和淋巴結中檢測到其表達。Burkle等［13］研究發(fā)現(xiàn)CXCR5在慢性淋巴細胞白血病病情的進展中發(fā)揮重要作用。CXCLl3和CXCR5的表達與HIV感染過程中B細胞機能障礙的形成有關。張巖等［14］檢測到其在胸腺瘤合并重癥肌無力的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，CXCL13及其受體CXCR5的表達更易引起上述疾病的發(fā)生。易誠青等［15］發(fā)現(xiàn)CXCL13和CXCR5與成骨活躍程度相關，并表現(xiàn)為明顯的時間與位點特征。鄒春華等［16］研究發(fā)現(xiàn)CXCR5的表達與肺癌組織學類型密切相關。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)其與結直腸癌組織學類型和復發(fā)有一定關系。

本研究結果顯示，CXCL13在結直腸癌淋巴結轉移灶中的表達高于原發(fā)灶，在正常的結直腸組織中未檢測到其表達。CXCL13在轉移灶淋巴結中的表達明顯高于正常淋巴結。CXCR5的表達與CXCL13具有相似的特征。由此可以看出，CXCL13及其受體蛋白CXCR5可以作為評估結直腸癌發(fā)病及轉移的新的指標。但是關于CXCL13及CXCR5在結直腸癌發(fā)病中的具體作用機制，仍需要進一步研究。通過觀察CXCL13及CXCR5的表達與臨床病理參數(shù)之間的關系，我們發(fā)現(xiàn)CXCL13及CXCR5的表達與結直腸癌的TNM分期和腫瘤的分化程度具有相關性。腫瘤的TNM分期越高，越容易檢測到CXCR5的表達;腫瘤的分化程度越低，越易檢測到CXCL13及CXCR5的表達。后者與曹寶森等［4］研究發(fā)現(xiàn)的CXCL13及CXCR5在非小細胞肺癌中的表達特點具有一定的相似性。

結合隨訪資料分析發(fā)現(xiàn)，無論是否有淋巴結的轉移，在有CXCL13及其受體蛋白CXCR5表達組中，其無進展生存期均短于CXCL13及CXCR5無表達者?？梢钥闯?，CXCL13及其受體蛋白CXCR5的表達，是結直腸癌不良預后的一個標志。這與Razis等［17］研究發(fā)現(xiàn) CXCL13及 CXCR5的表達對 Her2陰性乳腺癌患者預后的影響是一致的，然而對于Her2陽性的乳腺癌患者，CXCL13及CXCR5的表達卻是一個有利的預后因子。CXCL13及CXCR5如何與Her2基因發(fā)生相互作用以及其具體作用的機制，有待進一步研究。

KRAS基因是RAS基因家族的一種，定位于第12號染色上。在RAS基因家族中，KRAS對人類癌癥影響最大，它能控制調控細胞生長的信號通路;其發(fā)生異常時，則導致細胞持續(xù)生長，并阻止細胞自我毀滅。它參與細胞內(nèi)的信號傳遞，若KRAS基因發(fā)生突變，該基因永久活化，不能產(chǎn)生正常的RAS蛋白，使細胞內(nèi)信號傳導紊亂，細胞增殖失控而癌變［18～20］。當前研究其與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有較為明顯的關系，尤其是對結直腸癌的預后有較為明顯的關系。在KRAS未發(fā)生突變的情況下，使用分子靶向藥物帕尼單抗治療結直腸癌患者取得了較好的治療效果［21，22］。本研究發(fā)現(xiàn)，CXCL13 及其受體蛋白CXCR5的表達與KRAS基因的突變具有一定的相關性，我們推測CXCL13及CXCR5與KRAS基因的信號傳遞有一點關聯(lián)，其具體影響機制有待進一步研究。

本研究結果表明，趨化因子CXCL13及CXCR5蛋白在結直腸癌轉移灶中的表達高于其原發(fā)灶，提示其與結直腸癌的轉移有一定相關，其具體作用機制有待進一步探索。CXCL13及CXCR5蛋白表達陽性的結直腸癌患者其無進展生存期明顯低于CXCL13及 CXCR5陰性表達患者，提示 CXCL13及CXCR5是結直腸癌患者的不良預后因子，其具體機制有待進一步研究。CXCL13及CXCR5的表達與KRAS基因的突變有一定的相關性，CXCL13及CXCR5表達的患者中KRAS基因突變發(fā)生率較高，提示CXCL13及CXCR5可能參與KRAS基因信號的傳遞，其具體影響機制尚需深入探討。

［1］周松濤，高峰，張鑫，等.結直腸癌淋巴管生成與淋巴轉移的研究進展［J］.結直腸肛門外科，2012，18(5):333-337.

［2］高春芳，范乃軍，王秀麗，等.應用SELDI-TOF-MS技術初步建立結直腸癌區(qū)域淋巴轉移分類樹模型［J］.解放軍醫(yī)學雜志，2010，12(3):121-125.

［3］高友福，姜波健.進展期結直腸癌淋巴轉移規(guī)律的臨床研究［J］.中國普外基礎與臨床雜志，2000，7(1):27-29.

［4］曹寶森，李霞，常茂葉，等.CXCL13及其受體CXCR5表達與非小細胞肺癌淋巴結轉移的關系［J］.山東醫(yī)藥，2013，53(1):59-61.

［5］道書艷，郭葆玉.趨化因子CXCL13及其受體CXCR5研究進展［J］.國外醫(yī)學:分子生物學分冊，2003，25(4):200-203.

［6］Agesen TH，Sveen A，Merok MA，et al.ColoGuideEx:a robust gene classifier specific for stage II colorectal cancer prognosis［J］.Gut，2012，61(11):1560-1567.

［7］Chaput N，Svrcek M，Auperin A，et al.Tumour-infiltrating CD6+8and CD5+7cells predict patient outcome in stage II-III colorectal cancer.Br J Cancer，2013，109(4):1013-1022.

［8］梁棟，摘譯.結直腸癌流行病學特征的研究［J］.中國普外基礎與臨床雜志，2012，19(4):363.

［9］萬德森.結直腸癌流行病學與預防［J］.中國中西醫(yī)結合外科雜志，2011，17(1):3-7.

［10］Cho S，Song IH，Yang HC，et al.Prognostic factors of pulmonary metastasis from colorectal carcinoma［J］.Interact Cardiovasc Thorac Surg，2013，17(2):303-307.

［11］Breen EC，F(xiàn)atahi S，Epeldegui M，et al.Elevated serum soluble CD30 precedes the development of AIDS-associated non-Hodgkin's B cell lymphoma［J］.Tumour Biol，2006，27(4):187-194.

［12］Widney DP，Breen EC，Boscardin WJ，et al.Serum levels of the homeostatic B cell chemokine，CXCL13，are elevated during HIV infection［J］.J Interferon Cytokine Res，2005，25(11):702-706.

［13］Burkle A，Niedermeier M，Schmitt-Graff A，et al.Overexpression of the CXCR5 chemokine receptor，and its ligand，CXCL13 in B-cell chronic lymphocytic leukemia［J］.Blood，2007，110(9):3316-3325.

［14］張巖，王鐵栓，趙松.趨化因子CXCL13在胸腺瘤合并重癥肌無力發(fā)病中的作用［J］.中國老年學雜志，2012，32(12):2484-2486.

［15］易誠青，馬春輝，張國橋，等.CXCLl3和CXCR5在骨缺損成骨微環(huán)境中的表達特征［J］.上海交通大學學報:醫(yī)學版，2012，32(12):1536-1539.

［16］鄒春華，周青春，馮瑋，等.趨化因子受體CXCR5在肺癌中的表達及其意義［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2010，18(5):906-908.

［17］Razis E，Kalogeras KT，Kotoula V，et al.Improved outcome of high-risk early HER2 positive breast cancer with high CXCL13-CXCR5 messenger RNA expression［J］.Clin Breast Cancer，2012，12(3):183-193.

［18］Magliano MP，Logsdon CD.Roles for KRAS in pancreatic tumor development and progression［J］.Gastroenterology，2013，144(6):1220-1229.

［19］Demes M，Scheil-Bertram S，Bartsch H，et al.Signature of microsatellite instability，KRAS and BRAF gene mutations in German patients with locally advanced rectal adenocarcinoma before and after neoadjuvant 5-FU radiochemotherapy［J］.J Gastrointest Oncol，2013，4(2):182-192.

［20］ Ouerhani S，Bougatef K，Soltani I，et al.The prevalence and prognostic significance of KRAS mutation in bladder cancer，chronic myeloid leukemia and colorectal cancer［J］.Mol Biol Rep，2013，40(6):4109-4114.

［21］Parsons B L，Myers M B.Personalized cancer treatment and the myth of KRAS wild-type colon tumors［J］.Discov Med，2013，15(83):259-267.

［22］ Eklof V，Wikberg ML，Edin S，et al.The prognostic role of KRAS，BRAF，PIK3CA and PTEN in colorectal cancer［J］.Br J Cancer，2013，108(10):2153-2163.