王飛翔 賀慧霞

誘導性多潛能干細胞(induced pluripotent stem cells， iPSC)是Yamanaka 等[1]率先通過逆轉錄病毒介導， 將Oct3/ 4、Sox2、Klf4 和c-Myc 基因(這4 個基因又稱為Yamanaka 因子)轉入小鼠成纖維細胞， 誘導其發(fā)生重編程后得到的、與胚胎干細胞(embryonic stem cells， ESC)相似的多能干細胞。基于iPSC 的細胞替代治療不僅可避免ESC來源有限、免疫原性和倫理性這些關鍵問題， 而且可為多種疑難疾病的個體化治療帶來新的希望，具有深遠的科學價值和廣泛的應用價值。目前關于iPSC 獲取的方法、誘導效率、安全性等正不斷完善，iPSC 研究在口腔領域也有較大進展。本文主要就iPSC 技術的發(fā)展、口腔組織來源的iPSC 及iPSC 用于口腔組織再生的研究進展做一綜述。

1. iPSC技術的發(fā)展

從iPSC 技術誕生以來，一直面臨著誘導率低，自身安全性不足等問題，目前主要通過選擇不同組織來源的細胞、改變培養(yǎng)條件及誘導方法、減少轉錄因子和改進載體系統(tǒng)等方法來提高iPSC 的誘導率和安全性。

2. 誘導效率方面的發(fā)展

2.1 種子細胞來源的選擇 不同組織來源的成體細胞誘導為iPSC 的誘導率不同。最初的皮膚成纖維細胞的誘導率僅0.01%[1]。Sun N 等[2]研究發(fā)現(xiàn)脂肪組織來源的干細胞重編程為iPSC，其誘導率可達0.2%；羊水來源的細胞誘導為iPSC 的誘導率可達0.5%[3]，臍靜脈內皮細胞iPSC 誘導率可達2.5%-3%[4]。另外，相對于已分化的成體細胞，干細胞分化為iPSC 更加容易，而且誘導率較高。但轉化效率越高的細胞，越難獲得。

2.2 改變培養(yǎng)環(huán)境及改進誘導方法 培養(yǎng)環(huán)境的氧濃度對iPSC 的誘導效率也有影響。Yoshida Y 等[5]發(fā)現(xiàn)把iPSC 培養(yǎng)環(huán)境的氧濃度使通常的21%降到5%，iPSC 的生成效率可提高至原來的2.5-4.2 倍。Ban 等[6]利用仙臺病毒(Sendai virus)載體，可以使臍帶血細胞重編程為iPSC 的誘導率提高0.01%；YU 等[7]使用oriP/ EBNA1 載體重編程體細胞，誘導率可達1%。另外，添加小分子化學物質也可以提高誘導率。Esteban 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)過程中添加維生素C，可使誘導率提高至6.2%；Huangfu 等[9]發(fā)現(xiàn)DNA 甲基化和組蛋白去乙?；敢种苿┛商岣咧鼐幊绦?，尤其是丙戊酸鈉組蛋白去乙?；敢种苿墒怪鼐幊绦侍岣?00 多倍。而Hong 等[10]去除c－Myc 基因后用siRNA 阻斷P53 基因通路，發(fā)現(xiàn)也可將皮膚細胞轉化為iPSC 的成功率提高至10%左右。

3. 安全性方面的發(fā)展

3.1 減少轉錄因子數(shù)量 對大多數(shù)體細胞進行重編程時，一般會需要Oct4 及Sox2 兩個轉錄因子，或至少需要Oct4 這一因子。不同的因子組合對不同細胞的重編程效果不同，可根據(jù)供體細胞種類及其相應轉錄因子表達水平靈活選擇。如小鼠的神經(jīng)干細胞和神經(jīng)前體細胞，其本身高表達Sox2 和c-Myc，因此只用Oct4 和Klf4 兩種轉錄因子，甚至只用Oct4 一個轉錄因子就可將其重編程為iPSC。這無疑提高了iPSC 的安全性，因c-Myc 基因有致癌性，所以在構建iPSC 時應盡量避免使用。

3.2 載體系統(tǒng)的改進 目前使用的載體系統(tǒng)主要有逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、質粒載體、脂質體載體和非整合型附著體載體等。早期的iPSC 誘導主要采用逆轉錄病毒或慢病毒等載體，病毒介導的轉基因方式可實現(xiàn)目標基因穩(wěn)定表達，但病毒載體存在整合入宿主細胞基因組并導致腫瘤的問題，因此其安全性難以滿足需要。腺病毒載體整合進細胞基因組中的可能性較小，易于獲得無毒害副作用的或無病毒載體整合的iPSC，但誘導效率較逆轉錄病毒和慢病毒方法低得多。Okita 等[11]使用質粒載體，通過一個多順反子載體上的Oct4、Klf4、Sox2 及一個單獨質粒上的c-Myc，反復轉染小鼠胚胎成纖維細胞獲得iPSC，完全避免了使用病毒載體。Okita 等[11]還通過脂質體介導Yamanaka 因子獲得沒有外源基因插入的iPSC，但這種方法需反復轉染細胞且重編程效率很低，且不能完全避免表達載體整合入基因組中。Yu[7]等使用oriP／EBNA1 兩個元件的非整合型附著體載體攜帶Oct4、Sox2、Nanog、Lin28，將人成纖維細胞誘導為iPSC。載體系統(tǒng)的不斷改進雖然一定程度上提高了iPSC 的安全性，但與此同時細胞重編程效率也隨之降低。所以，如何在提高iPSC 安全性的同時也提高誘導效率是一個重要問題。

4. 口腔組織來源的iPSC及在全身疾病中的應用

4.1 牙齦來源的iPSC 牙齦是一種較容易獲得的組織，一般的牙科治療中常有切除牙齦，如果能將在牙齦中獲取的細胞成功誘導成iPSC，這將避免患者因取皮膚等組織引起的額外創(chuàng)傷。2010年，Yatani 等[12]通過引入4 個轉錄因子Oct3/ 4、Sox2、Klf4、c-Myc 或3 個因子Oct3/ 4、Sox2、Klf4 成功將成年野生型小鼠牙齦成纖維細胞誘導為iPSC[4 基因誘導的iPSC(GF-iPS-4F），3 基因誘導的iPSC(GF-iPS-3F)]。這些細胞表現(xiàn)出與ESC 相似的形態(tài)結構和生長特性，且表達ESC 的標志基因，畸胎瘤形成實驗顯示iPSC 可分化為所有三胚胎層來源細胞。研究還發(fā)現(xiàn)GF-iPS-4F 細胞的重組效率比鼠尾尖成纖維細胞高7 倍，而GF-iPS-3F 細胞重組過程相對時間較長、效率較低，但其在DNA 甲基化狀態(tài)和基因表達方面更接近于ESC。這些結果表明，從牙齦組織中獲得的牙齦成纖維細胞可重編程后轉化為iPSC，這給細胞重編程和多能性的基礎研究及將來的臨床應用提供了可靠的細胞來源。

4.2 牙髓來源的iPSC 牙髓組織來源豐富易于獲得。智齒牙髓細胞中含有豐富的牙髓干細胞，Takeda[13]從180 多個年輕患者的智齒中分離獲得牙髓細胞，發(fā)現(xiàn)這些牙髓細胞增殖能力強，易于培養(yǎng)且可長時間保存。Tamaoki 等[14]利用6 個不同發(fā)育階段的牙髓細胞系，通過逆轉錄病毒載體將Oct3/ 4， Sox2， Klf4， c-Myc 導 入 細 胞 系 誘 導iPSC 生成，并以人皮膚成纖維細胞(human dermal fibroblast HDF)為對照。結果發(fā)現(xiàn)：在6組牙髓細胞系中，有5 組均可被誘導為iPSC，且誘導效率明顯高于對照組，而另一組未能成功誘導的細胞系來源于年齡最大的捐獻者(24 歲，男性，牙根已發(fā)育完全)；此外，同法只導入Oct3/ 4，Sox2， Klf4 三個轉錄基因也成功將牙髓細胞誘導為iPSC ，只是3 基因誘導效率低于4 基因，免疫染色、RT-PCR 等技術顯示兩者在表達人胚胎干細胞特定標志物等方面均無差異，而且3 基因誘導方案由于避免啟用了c-Myc 這個致癌基因，在細胞安全性方面可能更有優(yōu)勢。此外，Beltr?o-Braga PC 等[15]誘導人牙髓干細胞(human dental pulp stem cells，hDPSCs)也成功獲得iPSC。且hDPSCs 誘導轉化為iPSC，重編程速度快，獲得的細胞具有類似ESC 的形態(tài)結構，可表達多能性標志物且有正常穩(wěn)定的染色體組型，體內和體外實驗均證明了其多能性特征。這表明hDPSCs 來源的iPSCs 也可為未來的細胞治療提供穩(wěn)定可靠的細胞體系。

4.3 牙周膜細胞誘導的iPSC 牙周膜(PDL)成纖維細胞是一種多潛能細胞，參與牙周膜的自我更新和牙周組織的再生。因此，相比于牙齦成纖維細胞和牙髓細胞，牙周膜成纖維細胞更具其獨特性，這被認為其或許更適于重編程為iPSC。2011年，Wada N 等[16]利用逆轉錄病毒載體轉導Yamanaka 因子，首次將牙周膜成纖維細胞重編程為iPSC。通過實時RT-PCR 基因檢測、組織學觀察形成畸胎瘤的能力結果表明：誘導出的iPSC表達人ESC 相關表面抗原SSEA3、SSEA4、GCTM-2、TG30 (CD9)、Tra-1-60 和人ESC 標志基因Oct4、Nanog 和Gdf3。體外研究顯示誘導的iPSC 可表達三胚層相關基因。與之不同的是2012 年Nomura Y 等[17]采用Nanog、Lin28 代替c-Myc 基因，同樣利用逆轉錄病毒載體將Oct3/ 4、Sox2、Nanog、Klf4、Lin28 五因子導入人牙周膜成纖維細胞(human periodontal ligament fibroblasts，HPDLFs)中，1 個月后，篩選出具ESC 樣的細胞群落，經(jīng)細胞STR 鑒定證實這些細胞 是 誘 導 得 到 的 iPSC (HPDL-iPSC)。 經(jīng)RT-PCR 檢測HPDL-iPSC 能夠表達多能性標志基 因Oct3/ 4、 Sox2、 DPP4A、 Nanog、 Klf4、c-Myc 和Lin28，而HPDLFs 只表達其中部分多能性基因，且Oct3/ 4、Nanog、Klf4 的表達水平低于HPDL-iPSC，而c-Myc 的表達水平高于HPDL-iPSC，進一步免疫印跡法、ALP 活性分析、免疫熒光染色等技術證實這些基因的表達和HPDL-iPSC 可分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞和神經(jīng)細胞的潛能，小鼠形成畸胎瘤實驗也表明其具有多向分化的潛能。這些結果表明HPDL-iPSC 的多能性，且說明HPDL-iPSC 具有良好的安全性。此外，在Nomura Y 等[17]的研究發(fā)現(xiàn)人牙周膜成纖維細胞的重編程效率達0.025%，相比于牙髓細胞(0.002-0.06%[14])和間充質細胞的重編程效率( 0.0026-0.0032%[18])，其更易誘導形成iPSC。以上結果表明牙周膜成纖維細胞誘導的iPSC 在細胞形態(tài)，分子標記和分化潛能等諸多方面都與ESC 極其相似，而且細胞來源簡單、便捷。因此，研究認為牙周膜成纖維細胞或許可作為誘導iPSC 的較佳細胞來源。

4.4 口腔來源的iPSC 在全身疾病中的應用 目前，采用口腔來源的iPSC 對全身疾病進行治療研究已取得初步成果。2012 年，Zou XY 等[19]使用慢病毒載體hSTEMCCA-loxP(一個多順反子性的單載體搭載Yamanaka 因子)將人牙乳頭干細胞(human stem cells of apical papilla ，SCAP)誘導為iPSC，然后利用Cre 重組酶介導的方法將轉入的基因和載體刪除，從而得到無外源基因(transgenefree)轉入的iPSC (TF-iPSCs)，這些TF-iPSCs 具有ESC 特性，并在體外試驗中證實其可分化為神經(jīng)源性細胞，表達神經(jīng)標記基因。因此，牙乳頭干細胞來源的iPSC 可作為神經(jīng)再生可靠的細胞來源。另外在Chen J 等[20]研究中還證實乳牙牙髓來源的iPSC(T-iPSCs)也可分化神經(jīng)細胞，將T-iPSCs 和皮膚成纖維細胞來源的 iPSC(F-iPSCs)分化的人神經(jīng)細胞基因對比研究，發(fā)現(xiàn)T-iPSCs 分化的神經(jīng)細胞不但適合神經(jīng)精神疾病的疾病模型，而且相比F-iPSCs 分化的神經(jīng)細胞可能還有潛在優(yōu)勢。Yoo CH 等[21]只利用兩個無致癌因子Oct4 和Sox2 成功將人牙髓細胞(hDPCs)轉化 為 人 iPSC (2F hDPC-hiPSCs)， 并 將 2F hDPC-iPSCs 誘導分化為血管內皮祖細胞(2F-hEPCs)用于缺血性血管疾病的治療研究。結果表明：相對其他細胞來源的hiPSCs，牙髓細胞來源的hiPSCs 分化為血管內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs) 效 率 較 高， 得 到 的2F-hEPCs 具有生成血管能力，并可繼續(xù)分化為功能性內皮細胞和平滑肌細胞。2F hDPC-hiPSCs具有強大的分化能力可生成EPCs，為病人特異性EPC 療法提出了新策略，特別是適合用于缺血性血管疾病治療。

5. iPSC用于口腔組織再生的應用研究

5.1 iPSC 向牙源性細胞誘導分化 牙形成過程中神經(jīng)嵴細胞(neural crest cells，NCs)起關鍵作用。將ESC 向NC 細胞定向誘導，可分化為神經(jīng)元細胞、雪旺氏細胞和間充質細胞，間充質細胞又可分化為脂肪細胞、軟骨細胞和成骨細胞[22]。基于此，Otsu K 等[23]推測iPSC 也可分化為NC 細胞，繼而用于牙再生。他們建立鼠胚胎成纖維細胞來源的iPSC 系， 將iPSC 定向誘導分化的細胞經(jīng)實時RT-PCR 和流式細胞儀檢測細胞表面標志mRNA及蛋白表達，證實分化得到的細胞為類神經(jīng)嵴細胞(neural crest like cells，NCLC)。將NCLC 和鼠牙源性上皮細胞聯(lián)合培養(yǎng)，2 周發(fā)現(xiàn)NCLC 細胞凝集在牙源性上皮周，免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)這些聚集細胞可表達牙間充質細胞(DMC)標志物Lhx6、Msx1、Pax9，從而表明NCLC 可分化為DMC。令人感興趣的是，一些NCLC 同時也表達成牙本質細胞標志物牙本質涎蛋白(DSP)，表明其也可分化為成牙本質細胞，而且血清和條件培養(yǎng)基更適合NCLC 向成牙本質細胞分化。此外，在細胞的增殖分化過程中金屬基質蛋白酶-3(MMP-3)也發(fā)揮重要作用。外源性MMP-3 可促進類成牙本質細胞的增殖。較低濃度(0.25 或2.5 ng/ mL)IL-1β可誘導MMP-3 促進iPSC 分化的類成牙本質細胞增殖[24]。另外，Wen Y 等[25]對iPSC 在牙組織工程中的作用也進行了研究。發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎成纖維細胞來源的miPSC 分化的細胞可表達牙源性和成骨性的基因譜。將其植入小鼠腎包膜下4 周，組織學結果顯示有類骨和類牙髓樣組織形成，表明miPSC 具有分化為牙源性細胞的潛能，可用于口腔組織再生。

5.2 iPSC 用于牙周組織再生 牙周組織再生研究是干細胞在口腔醫(yī)學領域應用的重要方向之一，也是近年來的研究熱點。賀慧霞等[26-27]將牙周膜干細胞分別與骨及粘骨膜組織工程支架材料HA／TCP、ADM 復合后體內移植，發(fā)現(xiàn)可顯著提高牙槽嵴高度及附著齦缺損的修復效果。然而牙源性干細胞雖然可用于牙周組織再生，但由于它們來源有限而難以在臨床上廣泛應用。iPSC 的出現(xiàn)為細胞移植治療帶來了新的希望，近年來，國內外已有許多文獻報道成功的將iPSC 誘導為間充質干細胞樣細胞(iPSC-MSC)。誘導分化得到的iPSC-MSC 兼有兩者的優(yōu)勢，其不僅保持了間充質干細胞的生物學特性，而且相比于傳統(tǒng)的MSC有更強的增殖分化能力，可作為理想的種子細胞用于牙周組織再生修復。更令人振奮的是Karlsson C 等[28]研究發(fā)現(xiàn)獲得的iPSC-MSC 不具有致瘤性，這提高了其在未來臨床應用的安全性。2013 年，Hynes K 等[29]將人包皮來源的iPSC 誘導分化為MSC 樣細胞，這些細胞具有MSC 的典型形態(tài)，表達MSC 的表面標記，將iPSC 來源的MSC 樣細胞移植入鼠牙周缺損模型，2 周觀察發(fā)現(xiàn)，實驗組(iPSC-MSC)牙周缺損區(qū)有大量礦化組織和牙周膜樣組織形成，面積覆蓋整個缺損區(qū)域。而對照組(未移植iPSC-MSC)只在牙周缺損邊緣區(qū)域有稀少的礦化組織形成。骨組織形態(tài)計量分析顯示實驗組新組織形成面積占缺損面積的51.31%，顯著高于對照組29.77%。這表明iPSC 定向分化的MSC 能促進牙周組織再生，是簡便易得、前景廣闊的細胞來源，可用于牙周病的再生治療。

牙周骨組織再生也是牙周再生的關鍵。Tang M 等[30]利用輔助載體pEB-C5 攜帶限定性因子誘導人骨髓CD34+間充質細胞重編程形成iPSC，并將其培養(yǎng)形成擬胚體后進一步篩選得到MSC 樣細胞，流式細胞檢測顯示得到的iPSC-MSC 持續(xù)高表 達MSC 表 面 標 志 物CD29， CD44，CD166 和CD73 等，并可分化為脂肪細胞、軟骨細胞和成骨細胞。將iPSC-MSC 接種于磷酸鈣骨水泥支架(Calcium phosphate cement，CPC)，可見細胞在支架上粘附和增殖，表現(xiàn)出良好的生物活性。且在成骨誘導培養(yǎng)基中堿性磷酸酶(ALP)顯著高于在對照組。這提示接種于CPC 支架的iPSC-MSC，在成骨誘導條件下具有良好的成骨分化能力，這為未來牙周及頜面部骨組織再生修復提供了新途徑。

6. 問題與展望

干細胞研究是再生醫(yī)學的基礎。iPSC 技術的出現(xiàn)是干細胞基礎研究領域的新突破，具有里程碑意義。iPSC 不僅來源，臨床應用可避免免疫排斥及倫理難題，在研究組織功能和篩選新藥、移植治療遺傳或退行性疾病等方面都具有廣闊的應用前景。但iPSC 技術同時也存在重編程效率低、安全性欠佳等問題，這是其應用領域面臨的重要挑戰(zhàn)。影響iPSC 生成效率和安全性的原因是多方面的，來源細胞的特性是關鍵因素之一。目前能通過細胞重編程為iPSC 包括：皮膚成纖維細胞、角質細胞、脂肪干細胞、骨髓及牙組織來源的間充質干細胞等等。然而，目前研究中仍主要以成纖維細胞作為主要的供體細胞用于誘導iPSC，但近些年隨著iPSC 技術在口腔領域的研究不斷發(fā)展深入，新的研究發(fā)現(xiàn)在相同誘導條件下，口腔組織來源的細胞具有相對更高的重編程效率，且牙源性細胞的獲取更加方便和安全，因而獨具優(yōu)勢，已引起iPSC 研究者的廣泛關注。相信隨著對iPSC 研究的不斷深入，其臨床應用的障礙將不斷取得突破，必將在醫(yī)學疑難疾病的治療中發(fā)揮越來越重要的作用。

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