高 艷 孫 靜 高玉光 郭晶晶 王青山

牙周病是危害人類口腔健康的主要疾病之一，是成人失牙的主要原因。牙周病的發(fā)生、發(fā)展及治療轉歸與全身及局部多種因素密切相關。研究表明，神經因素對牙周病的發(fā)生、發(fā)展及組織修復有重要的影響，但其作用機制并不清楚。以失神經支配的牙周炎動物模型來研究兩者之間的關系是目前較為理想的研究方法。在本課題前期研究中，成功利用絲線結扎加高糖飲食的方法建立了失神經支配下的大鼠牙周炎實驗模型[1]。本實驗比較了采用不同材質的結扎絲在建立牙周炎動物模型中的優(yōu)劣，探討一種更快速、更有效的建立失神經支配的牙周炎動物模型的方法。

1.材料和方法

1.1 實驗動物及分組 80只2月齡SPF級體重300±25g Wistar雄性大鼠(山東大學動物實驗中心提供)。隨機分為5組，每組16只，即假手術組(N)、離斷下牙槽神經+絲線結扎(P1)組、離斷下牙槽神經+正畸結扎絲結扎(P2)組、單純絲線結扎(P3)組、單純離斷下牙槽神經(P4)組。

1.2 實驗方法 大鼠稱重后，10%水合氯醛按0.4ml/100g劑量腹腔麻醉，15-30#K型根管銼依次適當擴大左側下頜第一磨牙與第二磨牙之間牙間隙，剝離牙齦。P1組雙股3-0絲線結扎左側第一磨牙，并將結扎線盡量置于齦溝內，暴露并離斷同側下牙槽神經[1]，術后高糖飼料和200g/L高糖水進行喂養(yǎng)[2]；P2組用直徑為0.25mm的正畸結扎絲結扎左側第一磨牙牙頸部，離斷同側下牙槽神經，術后高糖飲食喂養(yǎng)；P3組僅用雙股絲線結扎左側第一磨牙，術后高糖飲食喂養(yǎng)；P4組僅離斷左側下牙槽神經而不結扎第一磨牙，術后常規(guī)鼠糧和水喂養(yǎng)；N組暴露但不離斷神經，術后常規(guī)喂養(yǎng)。

1.3 觀察指標

1.3.1 大體觀察 在1周、2周、4周、6周分別對牙齦指數、出血指數、牙齒松動度、牙槽骨吸收情況、牙齦退縮的程度及牙周袋深度進行檢測。

1.3.2 針刺實驗 在各時間段對大鼠左側下頜區(qū)域行針刺實驗，測定下牙槽神經功能。

1.3.3 X線檢查 在各時間段分別用新鮮配制4%多聚甲醛溶液行心臟體外循環(huán)內灌注，初步固定后，分離其下頜骨并截取磨牙段，拍攝X線片。

1.3.4 組織病理學觀察 標本用100mL/L甲醛液固定6h，15%EDTA脫礦，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片厚5μm，常規(guī)HE染色，光鏡觀察。

2.結果

2.1 大體觀察 術后約2-3h后蘇醒。術后1-2d，實驗動物少量進食，厭活動。3-4d后漸漸恢復正常。創(chuàng)口愈合良好，無感染，無一意外死亡。

2.1.1 P1組 1周時，大鼠進食減少，體重下降，絲線周圍食物及軟垢滯留量多，無松動脫落現(xiàn)象；牙齦退縮，探診出血，根分叉區(qū)暴露，牙齒Ⅰ度松動。2周時，牙齦退縮明顯，根分叉暴露，與對側呈貫通狀吸收，牙齒Ⅲ度松動。結扎4周，牙齦從牙面剝離，質地松軟，探針出血明顯，有牙周溢膿傾向。牙齦退縮至根尖1/3處，牙根暴露處有牙石形成。結扎6周，牙齦退縮嚴重，炎癥充血不明顯，牙根周圍有牙石形成。

2.1.2 P2組 結扎1周，左側下頜下緣傷口處愈合良好，結扎絲無松動及脫落現(xiàn)象，牙齦充血、水腫，輕度退縮。結扎2周，牙齦水腫，色澤暗紅，齦溝加深，鋼絲結扎打結處有輕微齦增生。結扎4周,炎癥、水腫十分嚴重，牙齦從牙面剝離,鋼絲結扎處形成牙周袋,鋼絲被埋于牙周袋內，鋼絲結扎處牙齦增生明顯。結扎6周，牙齦嚴重退縮，呈暗紅色，質地松軟，探針出血明顯，根分叉暴露，有牙周溢膿傾向。

2.1.3 P3組 結扎1周，絲線無松動及脫落現(xiàn)象，周圍有大量食物及軟垢滯留，牙齦水腫、充血，質地松軟，根分叉區(qū)暴露。結扎14d，牙齦退縮至根中1/3處，根分叉暴露，探針可探入根分叉區(qū)，但未與對側貫通。結扎4周，絲線結扎處牙齦增生明顯，根分叉完全暴露，與對側形成貫通性病變。結扎6周，牙齦退縮，質地松軟，根分叉暴露，有牙石形成。

2.1.4 P4組 大鼠少動，毛色亮且順，左側下頜下緣傷口處愈合良好，牙齦色形質基本正常，無明顯炎癥性改變。進食量及體重沒有明顯改變。

2.1.5 N組 大鼠活動正常，左側傷口愈合良好，牙齦色形質正常，進食量及體重未見明顯改變。

2.2 針刺實驗結果 在術后不同時間段用大頭針刺大鼠雙側下頜區(qū)域，左側無逃避反應，右側逃避反應明顯。

2.3 X線檢查

2.3.1 P1組 1周時，牙周膜間隙增寬，牙槽嵴頂高度降低，骨白線消失，根分叉區(qū)呈低密度透射影像。2周時，牙槽嵴頂位于根尖1/3處，邊緣模糊，根分叉區(qū)呈透射影像。6周時，牙槽嵴頂位于根尖1/3處，邊緣較清晰，牙周膜間隙明顯增寬，根尖周呈透射影像。

2.3.2 P2組 2周時，牙槽嵴頂約位于根冠1/3處，邊緣模糊，根分叉區(qū)呈完全透射影像。6周時，牙槽嵴頂位于根尖1/3處，牙周間隙增寬，邊緣模糊不清。

2.3.3 P3組 1周時，牙周膜間隙增寬，牙槽嵴頂高度降低，骨白線消失，根分叉區(qū)呈低密度透射影像。2周時，牙槽嵴頂邊緣模糊，根分叉區(qū)呈透射影像。6周時，牙槽嵴頂位于根中1/3處，邊緣較清晰。

2.3.4 P4組 1周時，未有明顯變化。2周時，牙周膜間隙增寬，寬度較均勻。骨白線不清晰，牙槽嵴頂位置未見明顯異常。6周時，牙周間隙明顯增寬，牙槽嵴頂模糊，高度降低，固有牙槽骨密度降低。

2.3.5 N組 1周時，牙周膜間隙寬度均勻一致；牙槽嵴頂位于釉牙本質界附近，根分叉區(qū)及牙槽間隔骨質密度未見異常。其他時間段X線下觀察牙周組織情況與1周時相比未見明顯異常(圖1)。

2.4 組織病理切片觀察

2.4.1 P1組 結扎1周，結締組織內炎性細胞向根方彌漫浸潤，結合上皮附著位點向根方延伸；牙周韌帶纖維排列紊亂，出現(xiàn)斷裂；牙槽骨高度明顯降低，牙槽窩內壁出現(xiàn)大量破骨細胞及骨吸收陷窩。結扎2周，牙周膠原纖維破壞,出現(xiàn)斷裂、疏松、變性，排列紊亂，牙周膜間隙增寬；骨吸收陷窩增多。結扎4周，牙周間隙不規(guī)則增寬，牙槽嵴頂形態(tài)不規(guī)則，有死骨形成。結扎6周，牙周纖維排列趨于正常，慢性炎性細胞浸潤，骨吸收陷窩內破骨細胞數量減少(圖2)。

2.4.2 P2組 結扎1周,牙齦上皮潰瘍、糜爛，炎癥細胞浸潤。結扎2周，結合上皮增生,釘突向結締組織深部延伸；結締組織內炎癥細胞彌漫,毛細血管擴張充血；膠原纖維破壞，排列紊亂。結扎4周，炎性細胞向根方彌漫浸潤,結合上皮附著位點向根方延伸；牙周韌帶纖維排列紊亂，出現(xiàn)斷裂；牙槽窩內壁出現(xiàn)骨吸收陷窩及大量破骨細胞。結扎6周，牙周膜顯著增寬，纖維排列紊亂，牙槽骨破壞嚴重，可見纖維性變(圖3)。

2.4.3 P3組 結扎1周，牙周韌帶纖維排列紊亂,牙槽骨內壁形態(tài)變得不規(guī)則。結扎2周，牙槽骨內可見較多的骨吸收陷窩及纖維樣變。結扎6周，牙周纖維排列趨于正常，牙槽骨高度降低，慢性炎性細胞浸潤(圖3)。

2.4.4 P4組 各時間段，牙周組織無明顯炎癥反應。在實驗4、6周，牙槽骨骨小梁變細且較稀疏，血管和淋巴管擴張，牙周間隙不規(guī)則增寬(圖 4)。

2.4.5 N組 各時間段牙周組織無明顯變化(圖 5)。

3.討論

牙周病是多因素所致的牙周組織慢性炎癥性破壞性疾病，國內外大量研究證實神經因素與牙周炎的發(fā)生發(fā)展和牙周組織的再生修復密切相關[3-6]，Zavarella等[7]報道了1例因顱神經損傷導致同側上下頜嚴重牙周病的病例，推測支配牙周組織的神經損傷和牙周病的發(fā)病密切相關，但其具體作用及機制尚不清楚。

圖1 X線檢查圖片

圖2 P1組2周時組織學觀察

圖3 P2組6周時組織學觀察(HE，×4)

圖4 P3組6周時組織學觀察

實驗表明，單純離斷神經組(P4組)隨著失神經支配時間的延長，牙槽骨的密度和高度較假手術組(N組)有較明顯的降低，前期研究也表明[8]，下牙槽神經缺失能明顯加重牙周支持組織尤其是牙槽骨的破壞，但是單純的神經缺失不會形成牙周炎。要深入研究神經因素在牙周病發(fā)生發(fā)展及牙周組織再生修復中的重要作用，需要有穩(wěn)定可靠的動物模型。

圖5 P4組、N組6周時組織學觀察(HE，×4)

大鼠是一種較為常用的構建牙周炎模型的動物[9]，且大鼠的腦神經與人類相似，適合用于神經和精神性疾病的研究[10]。本實驗采用Wistar雄性大鼠作為動物模型，避免懷孕等對實驗的影響。

本實驗采用了牙頸部結扎聯(lián)合高糖軟食的方法建立牙周炎動物模型。為了明確不同材質結扎絲對牙周炎的影響，對絲線和正畸用結扎絲的建模效果進行了比較。結果表明，結扎絲不同對牙周組織的刺激不同，相同材質結扎絲，離斷下牙槽神經組較未離斷神經組嚴重。絲線結扎組(P1組)出現(xiàn)的較鋼絲結扎組(P2組)早且嚴重，建模效果好。究其原因，可能是絲線比結扎絲粗糙，吸水后體積有一定的膨脹，自潔作用差，相同喂養(yǎng)條件下，絲線比結扎絲更容易造成食物及菌斑滯留。程玨[11]等發(fā)現(xiàn)絲線結扎容易脫落，未能成功誘導出牙周炎模型。在本實驗中未發(fā)現(xiàn)有絲線脫落的情況，可能與以下因素有關：(1)在結扎過程中，用15-30#K型根管銼適當擴大了鄰間隙，采用這種方法不僅便于絲線結扎，還不會破壞鄰接關系，減少了絲線脫落的幾率。同時，在操作過程中對牙周組織形成機械刺激，有利于菌斑的附著和牙周炎癥的形成。(2)術后采用軟食和高糖飲水喂養(yǎng)，對絲線的磨損較小，而且高糖軟食能更利于菌斑堆積，更快的形成牙周炎模型。

[1]孫 靜，李 紓，高 艷，等.大鼠下牙槽神經離斷和牙周炎雙重動物實驗模型的建立[J].上?？谇会t(yī)學，2012，21(1):9-14

[2]蘇 軍，劉魯川，毛永利，等.SD大鼠牙周炎動物模型的建立[J].牙體牙髓牙周病學雜志，2006，16(11):612-615

[3]F Mignini，M Sabbatini，V D'Andrea，et al.Neuropeptides of human thymus in normal and pathological conditions[J].Peptides，2011，32(5):920-928

[4]Yan XZ，Ge SH，Sun QF，et al.A pilot study evaluating the effect of recombinant human bone morphogenetic protein-2 and recombinant human beta-nerve growth factor on the healing of Class III furcation defects in dogs[J].Periodontol，2010，81(9):1289-1298

[5]Lee HJ，Jeong GS，Pi SH，et al.Heme oxygenase-1 protects human periodontal ligament cells against substance P-induced RANKL expression[J].Periodontal Res，2010，45(3):367-374

[6]徐 娟，胡 敏.神經再生在種植體骨感知中的作用[J].中華老年口腔醫(yī)學雜志，2012，10(4):241-246

[7]Zavarella MM，Leblebicioglu B，Claman LJ，et al.Unilateral severe chronic periodontitis associated with ipsilateral surgical resection of cranial nerves V，VI，and VII[J].J Periodontol，2006，77(1):142-148

[8]高 艷，孫 靜，李 紓，等.離斷下牙槽神經對大鼠牙周炎進展影響的組織學改變[J].濱州醫(yī)學院學報，2011，34(6):422-426

[9]Klausen B，Evans RT，Ramamurthy NS，et a1.Periodontal bone level and gingival proteinase activity in gnotobiotic rats immunized with Bacteroides gingivalis[J].Oral Microbiol Immunol，1991，6(4):193

[10]趙光明，陳克敏，柴維敏，等.大鼠三叉神經解剖和MR成像[J].生物醫(yī)學工程與臨床，2007，11(5):348-351

[11]程 玨，李 霞，孫克勤，等.不同方法構建大鼠實驗性牙周炎模型的研究[J].中國藥物與臨床，2007，7(9):682-684