綜述, 審校

(南華大學醫(yī)學院病原生物學研究所,湖南衡陽421001)

疫苗被廣泛用于人類和動物預防感染性疾病。一種疫苗誘導免疫應答獲得保護與適當?shù)淖魟┘案咝У目乖f送系統(tǒng)密切相關(guān)。近年來一些合成的物質(zhì)能增強抗原誘導免疫應答能力,如脂質(zhì)體、質(zhì)粒DNA(pDNA)。脂質(zhì)體由單層或多層磷脂膜組成,是一種有效的傳遞系統(tǒng),但可能產(chǎn)生非特定的免疫刺激性信號和難以預料的不利作用[1];pDNA疫苗使用簡單,發(fā)展?jié)摿薮?但其本身免疫原性低,難以被細胞攝取,限制其發(fā)展與應用。因此,開發(fā)能將抗原遞送至特定的免疫細胞并增加遞送抗原的免疫原性的新型載體系統(tǒng),仍需廣泛深入研究。菌影(bacterial ghost,BG)平臺系統(tǒng)對遞送疫苗、藥物和活性物質(zhì)是一項創(chuàng)新性的技術(shù)。菌影是利用噬菌體PhiX174的裂解蛋白E[2]在細胞膜上形成一個跨膜通道,細胞質(zhì)從該通道釋放后得到的革蘭陰性菌的空菌體。菌影可以裝載藥物、蛋白質(zhì)、基因、酶及其它物質(zhì),還可形成封閉的囊泡。菌影和其它非生物疫苗相比,最大的優(yōu)點是其具有未被破壞的完整細胞壁結(jié)構(gòu),作為天然佐劑刺激宿主免疫系統(tǒng)應答,同時遞送特異性抗原給抗原提呈細胞(APC)或者活性物質(zhì)給靶細胞[3]。生產(chǎn)菌影高效、低成本、安全,制成凍干疫苗可以在室溫下保存數(shù)月[4]。此外,菌影可采用多種免疫途徑,如皮內(nèi)、肌肉、皮下、腹膜、口服和胃等,還可通過黏膜免疫,如口腔、鼻腔、直腸、陰道或眼等[5-7]。本文重點闡述菌影作為亞單位蛋白疫苗和DNA疫苗的載體的特性、菌影作為人用疫苗的發(fā)展?jié)摿霸趧游镆呙鐟梅矫娴淖钚逻M展。

1 菌影形成機制與制備

1.1 菌影形成機制

菌影的形成是通過控制裂解基因E的表達。該基因編碼的裂解蛋白由91個氨基酸殘基組成,通過與細菌內(nèi)膜或外膜融合,能在多種革蘭陰性細菌細胞膜和胞壁上形成40～200 nm的特異性跨膜孔道,包括核酸、核糖體在內(nèi)的所有細胞質(zhì)成分從跨膜通道流出,剩下的細菌空殼即為菌影。在裂解過程中菌影的細胞外膜和內(nèi)膜結(jié)構(gòu)仍保持完整。裂解蛋白E的裂解作用在細菌增殖的過程中進行,包括裂解蛋白E在細胞內(nèi)膜聚集和裂解蛋白E構(gòu)象的改變在細胞內(nèi)外膜形成一個封閉的細胞周質(zhì)間隙。

1.2 菌影制備

裂解基因E在控制表達的情況下許多種革蘭陰性細菌可以形成菌影,包括人和動物的非病原菌、致病菌和益生菌,如大腸桿菌菌株K12、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌、腦膜炎奈瑟菌、出血敗血性巴氏桿菌和益生菌大腸桿菌Nissle 1917等等。菌影的形成通過其生長和凋亡期里細菌的總數(shù)、增殖的細菌數(shù)以及光密度來判斷,可用流式細胞儀來檢測裂解基因E的效率、菌影的數(shù)量以及未裂解的細菌?？刂屏呀饣駿的表達能使菌影的轉(zhuǎn)化率達到99.9%,剩余的活細菌用β-丙內(nèi)酯滅活。此外,將金葡菌核酸酶A(SNUC)與裂解基因E一起表達,前者可降解宿主菌DNA和其它核苷酸,以避免致病基因或抗藥基因的水平轉(zhuǎn)移帶來的相關(guān)隱患,該方法已用于痢疾志賀菌菌影制備[8-9]。

2 菌影作為蛋白亞單位疫苗和DNA疫苗的載體

2.1 菌影作為亞單位蛋白的載體

DNA重組技術(shù)已用于將外源蛋白抗原錨定在菌影胞膜復合物上來生產(chǎn)菌影,或以菌影作為亞單位蛋白疫苗的載體將外源抗原裝載于菌影殼體中[9-11]。抗原可與菌影外膜蛋白融合呈現(xiàn)在菌影表面,或錨定在內(nèi)膜的N端、C端或N與C端的膜錨定位點,這些錨定位點不影響外源性抗原的正確折疊,能保持構(gòu)象表位的結(jié)構(gòu)和酶活性物質(zhì)的所有活性。此外,將目的抗原裝載入細胞周質(zhì)間隙可防止菌影生產(chǎn)過程中環(huán)境因素和凍干所致抗原的降解。細胞周質(zhì)間隙的類凝膠區(qū)域富含膜源性低聚糖,能在細菌裂解過程中將外膜和內(nèi)膜融合而將周質(zhì)間隙緊緊封閉。獨自存在或與S層融合蛋白SbsA/SbsB結(jié)合的靶抗原,通過與麥芽糖蛋白(MalE)的融合導出到周質(zhì)間隙。SbsA和SbsB結(jié)構(gòu)特點使其能為菌影內(nèi)腔裝載外源抗原,SbsA比SbsB裝載外源抗原的能力更強,因其能插入較大的片段如Omp26[12]。

2.2 菌影作為DNA編碼抗原的載體

菌影具有極強的裝載能力與裝載效率,能裝載大量的核酸。裝載菌影簡便,只需將凍干粉劑菌影重懸在含有高濃度的pDNA溶液中,再洗去未結(jié)合的pDNA即可。菌影裝載DNA量取決于溶液中DNA的濃度。有研究表明,一個菌影的裝載量可達6000個中等大小的質(zhì)粒[13]。質(zhì)?；蚓€性DNA與菌影胞膜之間的相互作用很可能是帶負電荷的DNA分子與帶正電荷的非極性內(nèi)膜之間的靜電作用[13]。此外,pDNA能被裝載入菌影內(nèi)并儲存,是因為pDNA能與菌影內(nèi)生物素葡聚糖胺或者聚賴氨酸結(jié)合。pDNA帶有的特定DNA序列(LacOs位點)與內(nèi)膜上的融合復合體LacI-L'膜錨點結(jié)合,使特異性自身固定的pDNA(pSIP)在裂解過程中被固定在細菌內(nèi)膜[14]。通過菌影遞送DNA給靶細胞有兩種機制:兩步法是先制備菌影、凍干成干粉狀,再裝載高量的目的DNA;一步法是采用pSIP系統(tǒng)直接制備帶有特異性pDNA的菌影[1]。

3 人用菌影疫苗的發(fā)展?jié)摿σ约皠游锞耙呙绲膽?/h2>

菌影系統(tǒng)是一個新型、無生命、高效的抗原和藥物遞送平臺,成為當前開發(fā)病毒性和細菌性疫苗的重要手段。研究表明,菌影對包括巨噬細胞、樹突狀細胞(DC)、腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞和上皮細胞在內(nèi)的許多細胞的生存能力和代謝活動無細胞毒性或遺傳毒性[1]。菌影具有完整的外部結(jié)構(gòu),能被APC表面受體如補體受體和Toll樣受體有效識別并吞噬[15]。在豬體內(nèi),胸膜肺炎放線桿菌菌影能增加APC表面MHC分子的表達并顯著增加APC刺激T細胞增殖的能力[16]。DC作為專職性APC,其吞噬活性和攝取能力取決于用于制備菌影的細菌菌株。雞體內(nèi)實驗表明,使用非耐藥質(zhì)粒篩選的腸炎沙門菌菌影和常規(guī)途徑篩選的菌影相比,免疫保護作用相當而生物技術(shù)安全性更高[17]。

3.1 人用菌影疫苗的發(fā)展?jié)摿?/h3>

大量動物實驗表明,菌影能引起針對菌體和目的抗原的特異性體液免疫和細胞免疫應答[18]。菌影有多種可選擇免疫途徑,如腹腔、皮內(nèi)、肌肉、皮下、胃內(nèi)、吸入或者靜脈免疫,裝載DNA的菌影在體內(nèi)轉(zhuǎn)染DC能誘導特異性體液免疫和細胞免疫應答。C57BL/6小鼠肌注帶有沙眼衣原體重組外膜蛋白的霍亂弧菌菌影能引起局部黏膜和全身的Th1型免疫應答,特異性抗原致敏的T細胞可被動轉(zhuǎn)移[19-20]。C57BL/6小鼠肌注表達沙眼衣原體孔蛋白B和多態(tài)性膜蛋白D的霍亂弧菌菌影后,能誘導持續(xù)強烈的系統(tǒng)和黏膜記憶性免疫應答[21]。用重組Omp18蛋白的幽門螺桿菌菌影對C57BL/6小鼠進行治療性免疫,Omp18特異性抗體的增加和胃部細菌的減少與對照組差異顯著[22]。以嗜血桿菌Omp26的大腸桿菌NM522菌影通過腸黏膜和(或)肺黏膜免疫大鼠產(chǎn)生IgG2a,誘導Th1型免疫應答,在Omp26支氣管內(nèi)加強免疫后增加更明顯,顯著清除呼吸道攻擊的細菌[12]。最近研究表明,傷寒沙門氏菌Ty21a菌影裝載HIVgp140 DNA后免疫小鼠,易被巨噬細胞RAW264.7吞噬并有效表達,誘導外周和腸黏膜抗體水平明顯高于裸露DNA免疫組小鼠[23]。帶有小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌突變基因msbB的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌菌影灌胃免疫BALB/c小鼠Th1/Th2混合型免疫應答,有效減低前炎癥細胞因子的分泌,以100倍最小致死量野毒株攻擊,獲得了80%的高保護率[24]。

以裝載編碼β-牛乳糖的pCMV的曼氏溶血桿菌菌影皮下和肌肉注射BALB/c小鼠,其體液免疫應答水平比用裸露DNA免疫至少高出一個數(shù)量級,菌影刺激特異性Th1和Th2型免疫應答,隨后轉(zhuǎn)換為Th2型應答,表明用于制備菌影的細菌株能調(diào)節(jié)抗原特異性T細胞免疫應答類型[25]。進一步研究小鼠APC,證實菌影具有強大的遞送編碼特異性抗原的pDNA給靶細胞的功能,轉(zhuǎn)染靶細胞表達抗原效率高達85%[13,25]。此外,以體內(nèi)轉(zhuǎn)染裝載pCMV β-牛乳糖體曼氏溶血桿菌菌影的髓源性DC靜注小鼠,在所有免疫鼠誘生了特異性抗β-牛乳糖的抗體,而且在免疫后觀察到識別MHCⅠ-β-牛乳糖抗原表位的T細胞釋放IFN-γ水平增加[25]。胸膜肺炎放線桿菌菌影刺激豬DC的結(jié)果與曼氏溶血桿菌、霍亂弧菌菌影共同培養(yǎng)刺激小鼠相似,DC表面表達的MHC分子和共同刺激分子增加[25]。定量分析菌影的加載量表明,低濃度的DNA(50質(zhì)粒/菌影)就足夠有效遞送給靶細胞,其轉(zhuǎn)染率高達82%[26]?？紤]到菌影DNA大加載量(6000質(zhì)粒/菌影)和最低濃度DNA即可成功轉(zhuǎn)染靶細胞(50質(zhì)粒/菌影),菌影內(nèi)部空間的高載荷量表明它們能運載多種編碼不同種類的抗原的質(zhì)粒和(或)其它的免疫活性物質(zhì)。

不同菌株的菌影能誘導不同動物模型和不同靶細胞的免疫應答,表明菌影能特異性刺激抗菌影的細菌株的有效體液和細胞免疫應答,菌影運載和遞送給靶細胞的抗原足能保護動物抗特異性菌株的攻擊感染。菌影可制備為不同的形式(氣溶膠、食物和液體)、可采用多種免疫途徑及上述的各種免疫刺激能力的這些特性,表明菌影有希望發(fā)展為多價疫苗。評價菌影免疫動物的結(jié)果有助于選擇最合適用做菌影的菌株,以刺激最有效的免疫應答類型抗特定疾病(病原體)。

3.2 獸類菌影疫苗

免疫途徑在獸醫(yī)實踐應用中極其重要。疫苗最好的免疫途徑是黏膜免疫,如口腔,鼻吸,眼內(nèi)和呼吸道的免疫。黏膜免疫比其它途徑免疫有以下優(yōu)點:使用方便,副作用少,便于多次加強免疫。滅活疫苗通過黏膜免疫通常不能起到全面的免疫保護作用,必須使用黏膜佐劑如去毒的不耐熱大腸桿菌毒素和霍亂毒素等來增強免疫作用。動物實驗中菌影作用于口腔、鼻腔、眼或者呼吸道的黏膜表面,在引起免疫應答的劑量范圍內(nèi)無任何不良反應[27]。組織培養(yǎng)試驗顯示,即便是高劑量條件下(1000菌影/細胞),菌影也不會引起細胞毒性或遺傳毒性[28]。黏膜免疫通常需要至少一次相同疫苗來加強免疫以獲得完全保護,這取決于菌影來源的菌株和遞送途徑。然而,使用出血性大腸桿菌菌影,一次直腸免疫即可獲得100%保護[29],因此對不同菌影的候選疫苗的劑量和免疫途徑需要深入研究。

許多致病性革蘭陰性細菌在不同的動物模型中被應用作為菌影。副豬嗜血桿菌菌影通過注射免疫可引起特異性IgG滴度、CD4+和CD8+T細胞比值顯著增加。在菌影刺激下豬DC表面表達共刺激分子和MHC分子明顯增加[30]。腸出血性大腸桿菌(EHEC)菌影胃內(nèi)免疫保護小鼠抗細菌的致死性攻擊感染,誘導體液免疫應答和T細胞產(chǎn)生IFN-γ,單劑量菌影免疫可獲得86%的保護率,而增加劑量可以到達93%[31]。兔和鼠動物實驗顯示多殺性巴氏桿菌菌影和溶血二氧化碳嗜纖維菌的菌影能誘導產(chǎn)生特異性抗體對其它巴斯德菌的血清型和野生型分離株有交叉保護作用。小鼠腹腔免疫巴氏桿菌影誘導完全免疫保護具有劑量依賴性[32]。在牛體內(nèi)溶血二氧化碳嗜纖維菌菌影比商品化疫苗能獲得更好的免疫保護作用[33]。

3.3 魚類菌影疫苗

魚類養(yǎng)殖業(yè)繁榮發(fā)展使得魚類生存空間狹窄,最易受愛德華氏菌和弧菌感染,而連續(xù)使用抗生素會導致耐藥菌產(chǎn)生和抗生素殘留,因此發(fā)展魚類疫苗刻不容緩。愛德華氏菌影疫苗是養(yǎng)殖魚業(yè)領域設計和發(fā)展新型疫苗的代表,在羅非魚分別腹膜內(nèi)注射愛德華氏菌菌影和用福爾馬林滅活的愛德華氏菌,結(jié)果顯示菌影獲得了更強的免疫保護[34]。此外,鰻弧菌菌影研究以用于預防魚類的弧菌病[35]。使用減毒活鰻弧菌為菌影被用于設計一種新型的減毒魚疫苗,已成功誘導抗弧菌的交叉保護性免疫。在這個新方法中,將攜帶裂解E基因的減毒鰻弧菌喂給魚類,使E基因在魚體內(nèi)激活表達,裂解減毒細菌形成菌影。這種新型疫苗有兩個主要優(yōu)點:菌影技術(shù)保證減毒株無毒力回復;外源抗原在細胞質(zhì)中表達或者外源抗原與主體病原菌外膜融合作為多價疫苗可誘導針對靶抗原和致病菌的免疫應答。大比目魚腹腔注射非致病性活大腸桿菌多價疫苗,在裂解基因E介導下目的抗原在體內(nèi)釋放并引起免疫應答。以這種疫苗免疫30天后,以嗜水氣單胞菌LSA34攻擊感染,大比目魚存活率達80%以上[19]。以上表明,菌影技術(shù)與活細菌載體聯(lián)合應用,可開發(fā)新的疫苗類型。

4 展 望

在當前的疫苗開發(fā)里菌影替代了傳統(tǒng)的滅活病毒和細菌的方法。菌影是一個新穎的、無生命的、高效的抗原和藥物遞送平臺。雖然菌影作為抗原載體的研究近幾年才開始,但是越來越多的學者開始關(guān)注這項技術(shù),它已經(jīng)顯示出很好的潛力。相信在不久的將來,菌影將在疫苗研究中發(fā)揮越來越重要的作用。

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