宋秀花，呂江玲，李文強(qiáng)，張景丹，石玉中，張瑞嶺，李 毅

（1.青島市精神衛(wèi)生中心，山東 青島266034；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng)453002；3.武漢市精神衛(wèi)生中心，湖北武漢，430022）

阿片成癮是精神活性物質(zhì)濫用中犒賞-渴求通路介導(dǎo)的一種強(qiáng)迫性行為，同樣也是阿片物質(zhì)濫用強(qiáng)大有力的享樂(lè)原則的反應(yīng)。一旦某種物質(zhì)成癮則標(biāo)志著復(fù)雜神經(jīng)適應(yīng)性機(jī)制的形成，導(dǎo)致了藥物耐受、渴求及復(fù)吸直至藥物濫用等［1］，造成了嚴(yán)重的社會(huì)和生物醫(yī)學(xué)問(wèn)題。Kappa阿片受體系統(tǒng)被用來(lái)研究應(yīng)激誘導(dǎo)行為及成癮行為［2］，并證實(shí)Kappa阿片受體活性與厭惡有關(guān)，負(fù)性調(diào)節(jié)獎(jiǎng)賞行為。本實(shí)驗(yàn)主要是通過(guò)測(cè)定CPA建立前后KOR蛋白表達(dá)水平來(lái)觀察阿片成癮戒斷后厭惡動(dòng)機(jī)形成的生物學(xué)基礎(chǔ)，為打破毒品的負(fù)性強(qiáng)化循環(huán)尋找可能的干預(yù)靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

鹽酸嗎啡注射液（morphine hydrochloride injection，東北制藥集團(tuán)公司沈陽(yáng)第一制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)為100305-1）鹽酸納洛酮注射液（naloxone hydrochloride injection，北京四環(huán)制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為20100207），兔抗大鼠 Kappa多克隆抗體（IMGENEX，批號(hào)IMG-71465），山羊抗兔二抗（北京中杉公司，批號(hào) SP9001）。

1.2 動(dòng)物及分組

選用72只SPF雄性SD大鼠，隨機(jī)分為3組。慢性嗎啡注射＋納洛酮催癮組（morphine＋naloxone，MN），簡(jiǎn)稱(chēng) MN組；慢性嗎啡注射＋生理鹽水“催癮”組（morphine＋saline，MS）和慢性生理鹽水注射＋納洛酮催癮組（saline＋naloxone，SN），分別簡(jiǎn)稱(chēng)MS和SN組。

1.3 慢性嗎啡注射

從第 1天（Day1）至第 7天（Day7），每天兩次（8AM；8PM），每次每千克體重為10 mg，腹腔注射（IP），共計(jì)注射6.5 d。

1.4 慢性嗎啡依賴(lài)納洛酮催癮戒斷CPA的建立

CPA建立基本上可以分為三個(gè)階段：條件化前期（preconditioning session）、條件化期（conditioning session）以及條件化后CPA測(cè)試期（test session）條件化前的適應(yīng)：在Day4，8AM的嗎啡或生理鹽水注射之后的2 h（10Am），將實(shí)驗(yàn)鼠逐個(gè)放入訓(xùn)練箱，讓其自由摸索黑側(cè)和白側(cè)，共計(jì)15 min（900 s），以適應(yīng)訓(xùn)練箱，并自動(dòng)記錄試驗(yàn)鼠在黑側(cè)和白側(cè)的時(shí)間。

條件化前期（Day5）：與Day4的處理一樣，并同時(shí)記錄試驗(yàn)鼠在黑側(cè)和白側(cè)的時(shí)間。偏好側(cè)的評(píng)定：Day5，實(shí)驗(yàn)鼠在一側(cè)的時(shí)間大于總時(shí)間的一半（450 s）。

條件化搭配期：Day6，在8AM的嗎啡／生理鹽水注射后2 h（10 AM），腹腔注射生理鹽水（1 ml／kg體重）后，把實(shí)驗(yàn)鼠限制在非偏好側(cè)30 min。4 h后（2PM），MN組和SN組腹腔注射納洛酮（0.3 mg／kg體重），MS組注射等體積的生理鹽水后，將實(shí)驗(yàn)鼠限制在偏好側(cè)30 min。

CPA測(cè)評(píng)期：在Day7，在8AM的嗎啡／生理鹽水注射后2 h（10AM），讓實(shí)驗(yàn)鼠在訓(xùn)練箱里自由摸索15 min，并自動(dòng)記錄試驗(yàn)鼠在兩側(cè)內(nèi)的時(shí)間。具體方法參考文獻(xiàn)［3，4］。

1.5 免疫組化標(biāo)本的制備

具體方法參考文獻(xiàn)［5］。

1.6 免疫組化結(jié)果的觀察與圖像分析（KOR蛋白表達(dá)測(cè)定）

每組選取免疫組織化染色切片各4張，4張圖片分別來(lái)自不同的動(dòng)物，使用Motic病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)量陽(yáng)性神經(jīng)元的平均灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)處理

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠CPA評(píng)定的結(jié)果

CPA條件化后，MN組實(shí)驗(yàn)鼠在伴藥側(cè)的時(shí)間（s）較條件化前期明顯減少，差異有顯著性（P＜0.01），MN組大鼠形成了明顯的CPA，MS組和SN組在伴藥側(cè)的時(shí)間結(jié)果顯示兩者之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

Tab.1 Aversion scores and time in naloxone-paired compartment at preconditioning session and test session（s，，n＝24）

Tab.1 Aversion scores and time in naloxone-paired compartment at preconditioning session and test session（s，，n＝24）

MN：Morphine＋naloxone；MS：Morphine＋saline；SN：Saline＋naloxone**P＜0.01 vs preconditioning session

Group Preconditioning session Test session Aversion scores MN 608.60±50.70 445.67±42.40**-179.83±38.92 MS 578.60±87.95 526.66±63.02-55.13±88.92 SN 553.63±86.94 550.69±78.11-19.99±37.79

2.2 大鼠杏仁核中央核KOR的表達(dá)水平

CPA建立前，MN組KOR的表達(dá)水平較對(duì)照組MS組和SN組差異無(wú)顯著性。CPA建立后MN組KOR蛋白表達(dá)水平升高（限于 SN組），差異有顯著性（P＜0.01，表 2）。

Tab.2 Kappa opioid receptor expression in the CeA at preconditioning session and test session（，n＝24）

Tab.2 Kappa opioid receptor expression in the CeA at preconditioning session and test session（，n＝24）

MN：Morphine＋naloxone；MS：Morphine＋saline；SN：Saline＋naloxone**P＜0.01 vs MSand SN

Group Preconditioning session Test session MN 132.89±10.35 99.56±7.67**MS 109.83±7.30 85.43±7.81 SN 121.00±2.73 118.25±1.71

3 討論

阿片受體主要的藥理學(xué)作用是作為止痛劑，它的副反應(yīng)包括藥物耐受和成癮［6］。與犒賞效應(yīng)、情緒狀態(tài)和認(rèn)知功能的調(diào)整有關(guān)。杏仁核尤其是CeA主要調(diào)節(jié)應(yīng)激引起的生理學(xué)反應(yīng)以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)多巴胺水平的變化［7］。

本研究發(fā)現(xiàn)，CPA是在強(qiáng)啡肽／Kappa阿片受體系統(tǒng)在反復(fù)刺激或激動(dòng)劑作用下產(chǎn)生的［8］。CPA建立后MN組大鼠Kappa阿片受體在CeA內(nèi)明顯高表達(dá)，大量研究證明Kappa阿片受體在可卡因成癮、自我給藥及其戒斷發(fā)揮著重要作用，Piras等人應(yīng)用慢性可卡因注射將大鼠分成可卡因組和生理鹽水組來(lái)觀察給藥后24 h和14 d各個(gè)腦區(qū)Kappa阿片受體的表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)，可卡因戒斷后CeA內(nèi)Kappa阿片受體的表達(dá)水平增加，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，并認(rèn)為Kappa阿片受體可能對(duì)可卡因急性戒斷起著重要作用［9］。

CPA模型建立后MN組大鼠出現(xiàn)明顯的戒斷癥狀，如濕狗樣抖動(dòng)，軀體拉伸，直立，跳躍，腹瀉等可能與Kappa阿片受體調(diào)節(jié)應(yīng)激引起的焦慮樣行為和厭惡行為有關(guān)［10］。許多的研究提示Kappa阿片受體可能調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)和記憶行為，連續(xù)6.5 d嗎啡注射后給予Kappa阿片受體拮抗劑納洛酮可能是加強(qiáng)了大鼠對(duì)其環(huán)境的厭惡記憶過(guò)程［11］，或是提高了獎(jiǎng)賞閾值［12］，戒斷令其極其厭惡。為了擺脫這種負(fù)面情緒促使其對(duì)成癮物質(zhì)的渴求最后導(dǎo)致復(fù)吸。

CPA大鼠，應(yīng)用納洛酮催癮戒斷后藥物渴求行為立即達(dá)到一定高度，這種改變是持久性的，失去了對(duì)過(guò)量藥物攝入的控制力。與對(duì)照組相比它們最大的不同是調(diào)整藥物攝取作為外界臨時(shí)變化的能力。對(duì)于大多數(shù)個(gè)體來(lái)說(shuō)，大腦會(huì)隨時(shí)調(diào)整自己的行為，恢復(fù)其正常的可塑性，并學(xué)會(huì)控制藥物攝取。而成癮者久而久之藥物刺激形成一種惡性循環(huán)，對(duì)藥物攝取不再節(jié)制，不能控制自己的行為最后導(dǎo)致強(qiáng)迫性復(fù)吸［13］。

藥物誘導(dǎo)KOR活性的增加與戒斷相關(guān)的負(fù)性情緒狀態(tài)相一致，通過(guò)拮抗戒斷癥狀減少藥物依賴(lài)戒斷的核心癥狀——復(fù)吸。因此，KOR拮抗劑可能對(duì)治療藥物依賴(lài)是有利的。當(dāng)物質(zhì)依賴(lài)達(dá)到一定程度，通過(guò)抑制KOR來(lái)減少?gòu)?qiáng)迫性復(fù)吸可能是有效的。因此抑制KOR活性可能是阻斷強(qiáng)迫性復(fù)吸的重要靶點(diǎn)［14］。

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