蘇艷麗，田 鵬 ，韓 芳 ，魏聞東 ，楊 倩

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 鄭州果樹研究所，河南 鄭州 450009；2.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南 中牟 451450)

梨樹在我國栽培歷史悠久，分布廣，經(jīng)濟(jì)價值大。梨多屬自花不育，遺傳上具有高度雜合性，這給梨的遺傳育種研究帶來了困難。通過花藥培養(yǎng)可獲得單倍體植株，再經(jīng)染色體加倍(人工或自然加倍)培養(yǎng)可獲得純系材料，這對梨的遺傳育種研究具有重要意義[1]。確定離體培養(yǎng)花藥中小孢子的發(fā)育時期是花藥培養(yǎng)中成功誘導(dǎo)單倍體雄核發(fā)育的關(guān)鍵，大多數(shù)果樹花藥培養(yǎng)最佳時期是單核期[2-7]。根據(jù)梨花藥誘導(dǎo)獲得胚狀體的成功報道[8-9]，單核靠邊期是梨組織培養(yǎng)中誘導(dǎo)單倍體植株的最佳接種時期。因此，梨花藥培養(yǎng)時確定小孢子的單核期至關(guān)重要。為了提高梨花藥培養(yǎng)接種取材的準(zhǔn)確性，對不同梨品種花粉的發(fā)育進(jìn)程進(jìn)行了觀察，了解其花粉在各發(fā)育時期的不同特點，從而為其花藥離體培養(yǎng)接種外植體的選擇提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試的西洋梨品種包括6月底7月初成熟的紅星和9月中旬成熟的Cascade與Homored共3個品種，供試的東方梨品種包括9月中旬左右成熟的滿天紅、紅酥脆、美人酥、紅香酥、紅香蜜和7月下旬成熟的綠寶石共6個品種。所有試材均采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所梨新品種選育資源圃。

1.2 方 法

3月9～20日的每天上午8點，每個品種采摘大小基本一致、同一物候期的芽各5個，采后立即拿回實驗室，用卡諾固定液固定12h，再轉(zhuǎn)入75％的酒精中保存，同時觀察記錄各品種所處的物候期。采用石蠟切片，用番紅-固綠對染，觀察各個品種花粉的發(fā)育情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 取材時東方梨各品種的物候期

采芽時東方梨各品種所處的物候期如表1。晚熟品種滿天紅、紅酥脆和美人酥是姊妹系，紅香蜜和紅香酥也是姊妹系，從表1中可以看出，滿天紅的物候期比美人酥、紅酥脆晚2d，紅香酥的物候期比紅香蜜晚4～5d，這與滿天紅比美人酥、紅酥脆成熟期晚，紅香酥比紅香蜜成熟期晚一致。而早熟品種綠寶石的物候期相對更晚，比晚熟品種滿天紅、紅酥脆、美人酥和紅香蜜均晚。

表1 采芽時東方梨各品種所處的物候期Table 1 Phenological periods of some oriental pear varieties when gathering buds

2.2 不同品種梨花粉各發(fā)育階段

2.2.1 3個西洋梨的花粉發(fā)育時期

不同日期觀察到的3個西洋梨品種的花粉發(fā)育進(jìn)程分別如表2和圖1A～F所示。3月17日觀察發(fā)現(xiàn)，3個西洋梨品種均無分裂相，其花粉母細(xì)胞緊密排列，處于花粉母細(xì)胞期(如圖1A)；3月18日，3個西洋梨品種的花粉母細(xì)胞開始分裂，有二核細(xì)胞出現(xiàn)(如圖1B～D)；3月19日，3個西洋梨品種出現(xiàn)大量的二核細(xì)胞，有少量二核細(xì)胞分裂為四分體(如圖1E)；3月20日，3個西洋梨品種處于四分體時期(如圖1F)。紅星成熟期為6月底7月初，Homored、Cascade的成熟期為9月中旬，雖然成熟期差別大，但3個品種花粉的發(fā)育時期基本一致，采芽時3個西洋梨品種的花芽均未萌動。

表2 3個西洋梨品種的花粉發(fā)育進(jìn)程Table 2 Pollen development processes of three occidental pear varieties

2.2.2 6個東方梨的花粉發(fā)育時期

不同日期觀察到的6個東方梨品種的花粉發(fā)育進(jìn)程分別如表3和圖2A～I(xiàn)所示。

滿天紅、美人酥和紅酥脆是姊妹系品種，滿天紅花粉開始發(fā)育的時間比美人酥、紅酥脆稍早些，但3個品種的發(fā)育進(jìn)程基本一致。3月9日觀察發(fā)現(xiàn)，滿天紅的花粉母細(xì)胞基本完成第一次減數(shù)分裂，處于二核細(xì)胞時期(如圖2B)，美人酥和紅酥脆處于花粉母細(xì)胞期，正在進(jìn)行減數(shù)分裂，染色體被紡錘絲牽引在細(xì)胞兩端(圖2A)；3月10日，這3個品種均處于二分體時期(如圖2C)；3月13日，3個品種均發(fā)育到四分體時期(如圖2D)；3月18日，3個品種的花粉均發(fā)育為成熟的花粉粒。

紅香酥和紅香蜜也是姊妹系品種，紅香酥花粉開始發(fā)育的時間比紅香蜜早。3月9日觀察發(fā)現(xiàn)，紅香酥處于花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂后期，有部分發(fā)育到四分體；3月10日，紅香酥發(fā)育到四分體時期(圖2E)；3月15日，紅香酥已發(fā)育到小孢子期(圖2F)；3月16日，紅香酥已發(fā)育為成熟的花粉粒。而3月9日觀察發(fā)現(xiàn)，紅香蜜處于花粉母細(xì)胞開始分裂期，部分發(fā)育為二核細(xì)胞(圖2G)；3月11日，紅香蜜發(fā)育到四分體時期(圖2H)；3月16日，紅香蜜也已發(fā)育為成熟花粉粒。

圖1 3個西洋梨品種的花粉發(fā)育時期Fig.1 Pollen development periods of three occidental pear varieties

綠寶石花粉的發(fā)育進(jìn)程如下所述：3月9日，其處于花粉母細(xì)胞期，細(xì)胞排列緊密，無分裂相；3月10日，花粉母細(xì)胞中有極少數(shù)分裂為二核細(xì)胞(如圖2I)；3月16日發(fā)育到四分體時期；3月18日已發(fā)育為成熟的花粉粒。與幾個晚熟梨品種相比，綠寶石花粉開始發(fā)育的時間最晚，但其最終發(fā)育為成熟花粉粒的時間卻基本一致。

6個東方梨品種從花粉母細(xì)胞開始分裂到發(fā)育為成熟的花粉粒，均持續(xù)8～10d，除四分體時期外，各個發(fā)育時期持續(xù)的時間均很短。東方梨早熟品種和晚熟品種花粉母細(xì)胞開始發(fā)育的時間相差2～3d，而其成熟期相差卻近2個月。

圖2 6個東方梨品種的花粉發(fā)育時期Fig.2 Pollen development periods of six oriental pear varieties

2.2.3 3個西洋梨和6個東方梨花粉發(fā)育進(jìn)程比較

根據(jù)表2和表3各品種花粉的發(fā)育進(jìn)程，結(jié)合表1中各品種的物候期分析得出，它們的單核靠邊期分別為：紅香酥在3月15日(花芽大量露白前2天)；滿天紅在3月15日(花芽大量露白前2天)；美人酥和紅酥脆在3月16日(花芽大量露白后1天)；綠寶石在3月17日(花芽大量露白期)；紅香蜜在3月12日(露蕾期)。

由表2和表3可知，西洋梨花粉開始發(fā)育的時間比東方梨晚，6個東方梨的花粉母細(xì)胞在3月9～10日均已開始減數(shù)分裂，而3個西洋梨的花粉母細(xì)胞到3月18日才剛進(jìn)行減數(shù)分裂，西洋梨花粉開始發(fā)育的時間比東方梨晚了8～9d。從花粉母細(xì)胞開始減數(shù)分裂到發(fā)育至四分體時期，西洋梨用時約3d，東方梨用時約6d，西洋梨花粉發(fā)育進(jìn)程比東方梨快。

3 結(jié)論與討論

東方梨和西洋梨花粉的發(fā)育過程均經(jīng)歷了花粉母細(xì)胞期、四分體時期、小孢子期和成熟花粉粒時期。

在姊妹系品種中，滿天紅的成熟期比美人酥、紅酥脆晚1周，而其花粉開始發(fā)育的時間比美人酥、紅酥脆卻大約早1d，但這3個品種花粉發(fā)育的進(jìn)程基本一致；紅香酥的成熟期比紅香蜜晚10d，其花粉開始發(fā)育的時間比紅香蜜早1d，而發(fā)育為成熟花粉粒的時間兩者一樣。成熟最早的綠寶石，與幾個晚熟梨品種相比，其花粉開始發(fā)育的時間最晚，但最終發(fā)育為成熟花粉粒的時間卻基本一致。這一觀察結(jié)果表明，成熟期越晚的品種，其花粉母細(xì)胞開始發(fā)育的時間越早；反之，成熟期越早的品種，其花粉母細(xì)胞開始發(fā)育的時間越晚。從梨花粉母細(xì)胞開始發(fā)育的早晚來看，從早到晚依次為紅香酥＞滿天紅＞美人酥、紅酥脆、紅香蜜＞綠寶石，其成熟期早晚的排序則相反。生產(chǎn)實踐也證明了這一點。

對各品種物候期的觀察結(jié)果表明，滿天紅的物候期比美人酥、紅酥脆要晚2d，紅香酥比紅香蜜的物候期晚4～5d，這一觀察結(jié)果表明，東方梨品種花粉的發(fā)育與其物候期呈密切正相關(guān)，而與其成熟期呈反相關(guān)，成熟期越早，物候期越晚，發(fā)育越晚。

6月底7月初成熟的紅星和9月中旬成熟的Homored與Cascade，雖其成熟期相差2個多月，但其花粉的發(fā)育進(jìn)程基本一致，均集中在3月18～21日。3月21日采芽時3個西洋梨品種的花芽均未萌動，說明西洋梨花粉的發(fā)育完成在花芽萌動前。

在東方梨花粉發(fā)育的整個過程中，早、晚熟品種的成熟期相差近2個月，但其花粉母細(xì)胞在3月8～10日均開始分裂，到3月18日發(fā)育為成熟的花粉粒，持續(xù)時間8～10d，除四分體時期外，各個發(fā)育時期的持續(xù)時間均很短，觀察中發(fā)現(xiàn)，個別減數(shù)分裂過程的持續(xù)時間長，這可能是由取材方面的緣故造成的。

西洋梨花粉開始發(fā)育的時間比東方梨晚，6個東方梨的花粉母細(xì)胞在3月9～10日均已開始減數(shù)分裂，而3個西洋梨的花粉母細(xì)胞在3月18日才剛進(jìn)行減數(shù)分裂，比東方梨開始發(fā)育晚了8～9d。從花粉母細(xì)胞開始減數(shù)分裂到發(fā)育至四分體時期，西洋梨用時約3d，東方梨用時約6d，西洋梨花粉發(fā)育進(jìn)程比東方梨快。這可能由于西洋梨花粉開始發(fā)育的時間晚，此期氣溫已升高，促使其花粉發(fā)育進(jìn)程加快。

觀察與分析結(jié)果表明，供試的幾個梨品種小孢子的單核靠邊期分別為：紅香酥在3月15日(花芽大量露白前2天)，滿天紅在3月15日(花芽大量露白前2天)，美人酥和紅酥脆在3月16日(花芽大量露白后1天)，綠寶石在3月17日(花芽大量露白期)，紅香蜜在3月12日(露蕾期)。在其他植物[10-12]中，人們將小孢子發(fā)育時期與花器外部形態(tài)特征聯(lián)系起來，以確定適宜花藥或花粉離體培養(yǎng)接種取材的最佳時期，但是，由于梨的花粉發(fā)育進(jìn)程較快，小孢子單核期的持續(xù)時間較短，觀察中分析，處于小孢子單核期的梨花器外部形態(tài)特征不突出，本研究結(jié)果可以作為梨花藥培養(yǎng)取材的參考依據(jù)，具體到某個品種時，為確保取材的準(zhǔn)確性，應(yīng)在參考時間段內(nèi)多次取材，或在參考時間段內(nèi)采樣壓片觀察后再取材。

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