李江濤，劉 宇，牛龍剛，崔麗娟，侯曉敏，李金艷，郭永強，張明升

人體正常的代謝和生理功能只有在酸堿度適宜的環(huán)境中才能維持，正常人體動脈血的pH 為7.35～7.45［1］。如病人有心臟疾病時，使乳酸增加，產(chǎn)生酸中毒。酸中毒又可以影響心臟功能［2］，導(dǎo)致心血管系統(tǒng)功能障礙，嚴(yán)重時可發(fā)生休克。鉀通道廣泛分布于血管平滑肌細胞［3］，并對血管張力的調(diào)節(jié)起著重要的作用。分布在冠脈平滑肌細胞上的電壓依賴性鉀通道（KV）、ATP敏感性鉀通道（KATP）和鈣激活鉀通道（KCa）在冠脈調(diào)節(jié)的各個方面起著重要的作用，并與心臟疾病的發(fā)生有密切的關(guān)系［4］。細胞外酸性環(huán)境可收縮大鼠冠狀動脈環(huán)［5］，其收縮可能與阻斷Cl－通道、Na＋／H＋交換、Na＋／Ca2＋交換、Ca2＋通道、一氧化氮生成和誘發(fā)內(nèi)鈣釋放有關(guān)。但是，細胞外酸性環(huán)境收縮大鼠冠狀動脈是否與K＋通道有關(guān)，卻尚未見報道。本實驗擬采用離體血管環(huán)實驗方法，觀察不同pH 值對大鼠離體冠狀動脈靜息張力的變化，并初步探討其與K＋通道的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 四氨基吡啶（4－AP）、格列苯脲（Gli）、四乙胺（TEA）均購自Sigma公司，其余試劑為市售分析純。正常生理鹽水溶液PSS：NaCl 144mmol／L，KCl 5.8mmol／L，MgCl21.2 mmol／L，CaCl22.5 mmol／L，葡萄糖11.1 mmol／L，HEPES5。60mmol／L KCl mmol／L：NaCl 89.8mmol／L，KCl 60mmol／L，MgCl21.2mmol／L，CaCl22.5mmol／L，葡萄糖11.1，HEPES 5 mmol／L。

1.2 實驗動物 健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，6周，體質(zhì)量為200g～250g，由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，在本動物室喂養(yǎng)2周后方可進行實驗。

1.3 實驗儀器與設(shè)備 離體微血管環(huán)張力測定儀DMT（丹麥DMT 公司），PowerLab生物信號采集分析系統(tǒng)及張力換能器（澳大利亞埃德儀器國際貿(mào)易有限公司），PHS－3C 精密pH 計（上海雷磁），HW－1000超級恒溫水浴鍋（成都泰盟科技有限公司），OlympusSZX－1LLB200 解 剖 顯 微 鏡（日 本），Sartorius BS124S精密天平等。

1.4 大鼠離體冠狀動脈環(huán)的制備 大鼠斷頭處死，立即取出心臟置于4℃的PSS中，在體式顯微鏡下將心臟打開，暴露室壁支，用顯微剪將血管周圍的組織剔除干凈，使冠狀動脈游離出來，注意不要牽拉血管。把游離出的冠狀動脈剪成2 mm 長的動脈環(huán)，放在盛有4℃的PSS的DMT 浴槽中，用鋼絲（直徑40 μm）固定在DMT 傳感器上。

1.5 實驗方法

1.5.1 冠狀動脈環(huán)活性的檢測 浴槽內(nèi)盛有5 mL 正常PSS溶液，持續(xù)通以100%氧氣，液溫維持在37℃。靜息60min后，用KCl（60mmol／L）收縮冠狀動脈環(huán)，靜息期間每隔15 min用37 ℃正常的PSS溶液沖洗1次。血管環(huán)張力通過DMT 換能系統(tǒng)采集，通過Chart7在計算機上記錄。當(dāng)KCl收縮冠狀動脈環(huán)的幅度大于1mN，并且相鄰兩次KCl收縮冠狀動脈環(huán)的幅度不超過10%時，認為冠狀動脈環(huán)的活性良好，可以開始正式實驗。

1.5.2 細胞外環(huán)境pH 值梯度降低對大鼠冠狀動脈環(huán)張力的影響 在靜息狀態(tài)下，將浴槽內(nèi)pH7.4的正常PSS液更換為pH7.2的PSS液，待反應(yīng)達坪臺后，將浴槽內(nèi)的液體依次更換為pH 值為7.0、6.8、6.6的PSS液，觀察細胞外偏酸性環(huán)境對大鼠冠狀動脈環(huán)張力的影響。以pH 值為6.6的最大收縮幅度為100%，計算不同pH 值下大鼠冠狀動脈環(huán)收縮的百分率。

1.5.3 不同濃度KV、KATP、KCa通道阻斷劑對細胞外環(huán)境pH 值梯度降低時大鼠冠狀動脈環(huán)張力的影響 在靜息狀態(tài)下，向浴槽內(nèi)分別加入不同濃度KV、KATP、KCa通道阻斷劑：KV 通道阻斷劑4－AP（0.3mmol／L、1mmol／L）、KATP通道阻斷劑Gli（0.003mmol／L、0.01mmol／L、0.03mmol／L）、KCa通道阻斷劑TEA（1mmol／L、3mmol／L），預(yù)孵15min，將浴槽內(nèi)的液體更換為pH7.2的PSS液，待反應(yīng)達坪臺后，將浴槽內(nèi)的液體依次更換為pH 值為7.0、6.8、6.6的PSS液，分別觀察不同濃度4－AP、Gli、TEA 對pH 值梯度降低時大鼠冠狀動脈環(huán)張力的影響。以藥物未干預(yù)時pH 值梯度降低引起大鼠冠狀動脈環(huán)張力的變化為對照組，以對照組pH 值為6.6的最大收縮幅度為100%，分別計算預(yù)孵不同濃度4－AP、Gli、TEA 時不同pH 值下大鼠冠狀動脈環(huán)收縮的百分率。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0分析，用Graphpad Prism6作圖。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用t檢驗和重復(fù)測量。

2 結(jié) 果

2.1 細胞外環(huán)境pH 值梯度降低對大鼠冠狀動脈環(huán)張力的影響 在靜息狀態(tài)下，隨細胞外環(huán)境pH 值梯度降低，大鼠冠狀動脈環(huán)的靜息張力逐漸增大。以pH 值為6.6的最大收縮幅度為1 00%，pH7.2、pH7.0、pH6.8的最大收縮率分別為（4.51±1.48）%、（42.74±8.32）%、（80.18±5.63）%。

2.2 不同濃度KV 通道阻斷劑對細胞外環(huán)境pH 值梯度降低時大鼠冠狀動脈環(huán)張力的影響 KV 通道阻斷劑4－AP 對pH值梯度降低引起大鼠冠狀動脈環(huán)的收縮有抑制作用。4－AP 0.3mmol／L在pH6.6時能減弱大鼠冠狀動脈環(huán)的收縮幅度，其最大收縮率為（85.85±6.61）%，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；4－AP 1 mmol／L 在pH7.0、pH6.8、pH6.6時均能減弱大鼠冠狀動脈環(huán)的收縮幅度，其最大收縮率分別為（15.39±9.68）%、（42.06±12.81）%、（55.75±15.66）%，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。且在pH6.6時，4－AP 1mmol／L減弱程度比4－AP 0.3mmol／L強，兩者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 不同濃度KATP通道阻斷劑對細胞外環(huán)境pH 值梯度降低時大鼠冠狀動脈環(huán)張力的影響 KATP 通道阻斷劑Gli對pH 值梯度降低引起大鼠冠狀動脈環(huán)收縮的作用呈雙向性。Gli 0.003mmol／L在pH6.8、pH6.6時能增強大鼠冠狀動脈環(huán)的收縮幅度，其最大收縮率分別為（114.12±15.62）%、（120.24±13.78）%，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；Gli 0.01 mmol／L在pH6.8、pH6.6時能減弱大鼠冠狀動脈環(huán)的收縮幅度，其最大收縮率分別為（56.19±3.98）%、（59.07±5.52）%，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Gli 0.03 mmol／L 在pH6.8、pH6.6時能減弱大鼠冠狀動脈環(huán)的收縮幅度，其最大收縮率分別為（46.19±8.64）%、（29.73±6.12）%，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。且在pH6.6 時，Gli 0.03 mmol／L對大鼠冠狀動脈環(huán)收縮幅度的減弱程度比Gli 0.01 mmol／L強，兩者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 不同濃度KCa通道阻斷劑對細胞外環(huán)境pH 值梯度降低時大鼠冠狀動脈環(huán)張力的影響 KCa通道阻斷劑TEA 對pH值梯度降低引起大鼠冠狀動脈環(huán)的收縮有增強作用。TEA 1 mmol／L在pH7.0、pH6.8時能增強大鼠冠狀動脈環(huán)的收縮幅度，其最大收縮率分別為（68.37±17.77）%、（103.2 2±10.27）%，與對照組相比均有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；TEA 3 mmol／L在pH7.0、pH6.8、pH6.6時能增強大鼠冠狀動脈環(huán)的收縮幅度，其最大收縮率分別為（64.97±11.79）%、（119.32±17.81）%、（134.77±18.20）%，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

冠心病嚴(yán)重危害人類健康，其發(fā)生發(fā)展與心肌缺血有著密切的關(guān)系［6］。心肌缺血會使心肌細胞發(fā)生酸中毒，酸中毒會降低心肌收縮力，加重心肌損傷，使心臟疾病加重［7，8］。

鉀通道活性的改變可導(dǎo)致動脈平滑肌細胞膜電位去極化或超極化，并在參與動脈血管舒縮調(diào)節(jié)中起著重要的作用［9］。本實驗著重研究在冠脈調(diào)節(jié)中起著重要作用，與心臟疾病的發(fā)生密切相關(guān)的KV、KATP和KCa通道與細胞外酸性環(huán)境引起冠脈收縮關(guān)系。KV 通道阻斷劑4－AP對pH 值梯度降低引起大鼠冠狀動脈環(huán)收縮的有抑制作用，其抑制作用與pH值和4－AP的濃度有關(guān)。pH 值越小，4－AP 濃度越大，抑制作用越明顯。KATP通道阻斷劑Gli對pH 值梯度降低引起大鼠冠狀動脈環(huán)收縮的作用有雙向性，這種雙向性與pH 值和Gli的濃度均有關(guān)系。Gli低濃度（0.003 mmol／L）在pH6.8、pH6.6時能增強時大鼠冠狀動脈環(huán)的收縮，而Gli高濃度（0.01mmol／L和0.03mmol／L）在pH6.8、pH6.6對大鼠冠狀動脈環(huán)的收縮卻有抑制作用。KCa通道阻斷劑TEA 對pH 值梯度降低引起大鼠冠狀動脈環(huán)收縮有增強作用。TEA 濃度越大，對大鼠冠狀動脈環(huán)收縮的增強作用越明顯。本實驗說明pH 值梯度降低引起大鼠冠狀動脈環(huán)的收縮可能與KV 通道開放、KATP通道及KCa通道關(guān)閉有關(guān)。

本實驗僅從肌源學(xué)方面探討了細胞外酸性環(huán)境引起大鼠冠狀動脈環(huán)收縮與KV、KATP和KCa通道的關(guān)系，其具體機制研究還有待從電生理學(xué)等方面進一步證實。

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