胡誕寧

2012年Schwartz等[1]在Lancet上發(fā)表論文，報告用人胚胎干細(xì)胞 (human embryonic stem cell,hESC)分化而來的的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞 (retinal pigment epithelium,RPE)移植治療年齡相關(guān)性黃斑變性 (age-related macular degeneration,AMD) 與Stargadt黃斑營養(yǎng)不良各一例獲得成功 。這是應(yīng)用hESC分化而來的細(xì)胞作臨床移植取得成功的首次報告,對細(xì)胞移植與干細(xì)胞的臨床應(yīng)用都具有重要意義。本文復(fù)習(xí)有關(guān)文獻(xiàn)，對RPE移植的適應(yīng)證、取材、療效；hESC分化而成的RPE(hESC-RPE)的實驗研究以及臨床移植的效果及存在問題等進(jìn)行討論，并展望了hESC-RPE移植的前景。

一、RPE功能及有關(guān)疾病

RPE是介于脈絡(luò)膜與神經(jīng)視網(wǎng)膜之間的單層色素上皮細(xì)胞，具有很多重要功能，如吞噬感光細(xì)胞外節(jié)、維生素A代謝、水與離子輸送、合成有黏合作用的細(xì)胞外基質(zhì)、黑色素的遮光、抗氧化作用以及制造生長因子、細(xì)胞因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子等。RPE的受損可造成視網(wǎng)膜(尤其是感光細(xì)胞)和脈絡(luò)膜的損害，嚴(yán)重影響視功能。應(yīng)用RPE移植，可能有助于修復(fù)及重建功能[1]。

RPE的損害可引起多種眼病，包括AMD和幾種遺傳性視網(wǎng)膜病等。其中AMD是老年人致盲主要原因之一，可分干型與濕型兩型，干型主要是黃斑區(qū)RPE和感光細(xì)胞的損害，RPE的病損又是導(dǎo)致感光細(xì)胞受損的重要環(huán)節(jié)。如能將正常的RPE植入視網(wǎng)膜下，有可能保護(hù)殘留的感光細(xì)胞和視力。濕型是由于視網(wǎng)膜下有新生血管形成，進(jìn)而導(dǎo)致黃斑水腫與出血，如通過手術(shù)切除視網(wǎng)膜下新生血管膜，常損及殘存的RPE，引起術(shù)后視力下降，如在手術(shù)時同時作RPE移植，應(yīng)有可能保存視力。因此RPE移植具有重要的臨床意義[2-4]。

二、RPE移植治療眼病的現(xiàn)況

應(yīng)用hESC分化而來的RPE（hESC-RPE）移植治療眼病是在RPE移植的基礎(chǔ)上發(fā)展而成的。其適應(yīng)證、移植方法、療效、并發(fā)癥以及免疫排斥反應(yīng)與RPE移植有不可分割的聯(lián)系。不了解RPE移植的效果與存在問題，就無法理解hESC-RPE移植的價值與意義。因此就RPE移植治病眼病的現(xiàn)況作一簡短復(fù)習(xí)。

人眼RPE的分離培養(yǎng)與體外研究方法是Gouras(Columbia大學(xué))與筆者(Johns Hopkins University)在二十世紀(jì)80年代初分別建立的[5-6]。經(jīng)過30多年的發(fā)展，人類RPE的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)己較成熟。在技術(shù)熟練的實驗室，RPE在體外培養(yǎng)中可分裂20～30次或更多(擴增100萬～10億倍)。因此從尸體眼球取得RPE，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)擴增并無困難，為RPE移植奠定了基礎(chǔ)。

Peyman(1991)首先對2例濕型AMD手術(shù)切除網(wǎng)膜下新生血管膜后作了RPE移植[7]。根據(jù)供材來源可分為自體或異體移植，各有其優(yōu)缺點。

三、異體RPE移植

由于RPE在視網(wǎng)膜之下，難以從自體取得，因此開始時多為異體移植，取自胎兒或成年人尸體眼球，經(jīng)或不經(jīng)培養(yǎng)后植入RPE缺失區(qū)的視網(wǎng)膜下腔[2-4，7-8]。

美國的Gouras與瑞典眼科學(xué)家合作，做了較多例RPE移植，將來自胎兒的RPE培養(yǎng)后取下，接種至黃斑區(qū)，治療對象為干型或濕型AMD。原先估計視網(wǎng)膜下腔為免疫赦免區(qū)，對異體RPE不會發(fā)生排斥反應(yīng)，但術(shù)后濕性患者全部在三個月內(nèi)發(fā)生排斥反應(yīng)，表現(xiàn)移植區(qū)熒光滲漏及黃斑水腫和視力降低，可能由于濕型已有血—視網(wǎng)膜屏障破壞，易發(fā)生排斥反應(yīng)[2]。(hESC-RPE移植研究避開了濕型病例,即基于此)。干型患者術(shù)后半年內(nèi)尚無不良反應(yīng)，但較長時間觀察后也有部分患者發(fā)生排斥反應(yīng)，與移植的細(xì)胞量有關(guān) (詳見hESC-RPE移植存在問題 )[2，4，8]?；谠摻M的教訓(xùn)，異體 RPE 移植已較少施行，直到hESC-RPE研發(fā)成功，才重新試用異體細(xì)胞于干型患者。

四、自體RPE移植

由于異體RPE移植易有排斥反應(yīng)，近10年內(nèi)報告的RPE基本上均為自體RPE移植[9-13]。通常用于濕型AMD，手術(shù)切除視網(wǎng)膜下新生血管膜時同時作RPE移植。供材來自同一眼非黃斑區(qū)部位，切開視網(wǎng)膜后切下小片帶有脈絡(luò)膜的RPE，直接移植至切除新生血管膜區(qū)的視網(wǎng)膜下。本法已有較多報告，術(shù)后均無排斥反應(yīng)，但手術(shù)并發(fā)癥很多，包括視網(wǎng)膜脫離，出血，增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病等。嚴(yán)重?fù)p害視力[9-13]，這可能與手術(shù)損傷有關(guān)。此外，RPE移送過程中只要有少量細(xì)胞脫落于玻璃體腔內(nèi)，即可能引起增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病[9-13]。

五、自體虹膜色素上皮細(xì)胞(IPE) 移植

由于自體RPE移植并發(fā)癥多，異體RPE移植又有排斥反應(yīng)，因此亟需另辟途徑。IPE與RPE胚胎上為同一來源，如能具有同樣功能，則有可能用IPE代替缺損的RPE。作者在1992年建立了人類IPE的分離培養(yǎng)方法[14]，此后又創(chuàng)建了從小片虹膜切除標(biāo)本作分離培養(yǎng)的技術(shù)[14]。目前應(yīng)用此方法，在技術(shù)熟練的實驗室均能分離培養(yǎng)IPE，滿足移植的要求。經(jīng)體外培養(yǎng)及動物實驗，在己測試的RPE功能中，如吞噬功能、維生素A代謝、黑色素作用、以及制造生長因子、細(xì)胞因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子等方面。IPE都能具有類似RPE的功能。遺傳性RPE缺陷的鼠作IPE移植?？煞乐够蜓泳徱暰W(wǎng)膜變性的發(fā)生[16-19]。

手術(shù)時對濕型AMD切除視網(wǎng)膜下新生血管膜后，將取自患者自身虹膜切除術(shù)標(biāo)本經(jīng)過體外培養(yǎng)擴增后，注入視網(wǎng)膜下腔。如RPE缺損區(qū)較小，IPE也可不經(jīng)培養(yǎng)，直接進(jìn)行接種[20-24]。至今在西歐和日本己有五組臨床報告，施術(shù)百例左右，移植后一般無排斥反應(yīng)或其他并發(fā)癥，安全無害。術(shù)后能保存視功能，視力等于或稍優(yōu)于術(shù)前[20-24]。

六、hESC-RPE移植的意義

由上可見，對濕型AMD自體RPE移植并發(fā)癥很多，異體RPE移植必被排斥，自體IPE移植較安全。近年由于抗VEGF藥物治療濕型AMD有較好療效，手術(shù)切除新生血管膜及細(xì)胞移植已無必要。對干型AMD，RPE移植仍有需求，但一般不敢輕試自體RPE移植，異體RPE移植又可能發(fā)生免疫排斥。

用ESC分化的細(xì)胞種類，最有價值的應(yīng)是不易從尸體分離培養(yǎng)得到的細(xì)胞，如胰島細(xì)胞等，而分離培養(yǎng)尸體RPE毫無困難。異體RPE移植的困難不在于供材而在于免疫排斥。hESC分化來的RPE必是異體RPE，似無根本性改進(jìn)。因此，做hESC-RPE移植看來似乎逆理。很可能研究者目的在于利用RPE移植己積累的豐富經(jīng)驗與知識，探索用hESC分化來的細(xì)胞作臨床移植的可能性，更勝過解決對某一眼病治療的實際需要。

七、從ESC定向分化為RPE的體外及動物試驗

近年來已有較多報告，應(yīng)用各種藥物在體外促使ESC定向分化為RPE取得成功，將hESC-RPE移植至實驗動物的視網(wǎng)膜下腔后RPE能存活，表達(dá)一定功能，亦未發(fā)生腫瘤等并發(fā)癥[25-33]。移植方法可以是將細(xì)胞懸液注入視網(wǎng)膜下腔，也可以是將貼有單層RPE的載體放入視網(wǎng)膜下[31-32]。以上試驗為hESC-RPE的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

在鑒定ESC定向分化為RPE是否為完全分化，具有全部功能的正常RPE時，早期僅檢測幾種功能，例如吞噬功能、制造黑色素、維生素A代謝、極性和屏障功能等，應(yīng)用的方法有免疫組化和western blot等[25，30-33]。但具有幾種RPE功能的細(xì)胞不等于具有全部功能。常態(tài)下能生存的細(xì)胞不等于在環(huán)境因素改變時能具有正常的應(yīng)變功能。近年的進(jìn)展是對正?；蚨ㄏ蚍只玫腞PE作全面的基因轉(zhuǎn)錄檢測，進(jìn)行比取，從而判斷其功能。例如Liao等[34]對人胚胎RPE，hESC-RPE，從iPSC分化來的RPE，未分化ESC，成纖維細(xì)胞等作了檢測，發(fā)現(xiàn)在87個RPE標(biāo)志性基因的表達(dá)上，從ESC或iPSC分化來的RPE與人胚胎RPE大體相似。但有21個基因僅表達(dá)于正常胚胎RPE，而不見于hESC-RPE。這些表達(dá)差異的基因，主要是與眼，特別是晶狀體的發(fā)育有關(guān)。我國同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院更檢測了從正常RPE和hESC-RPE的miRNA的表達(dá)譜，認(rèn)為亦有助于hESC-RPE的鑒定[35]。

八、用hESC-RPE移植治療視網(wǎng)膜疾病的臨床報告

美國加州大學(xué)洛杉磯分校眼科的Schwartz等[1]報告了用hESC-RPE移植治療AMD與Stargadt黃斑營養(yǎng)不良各1例。細(xì)胞系由Advanced Cell Technology公司供應(yīng)，來自hESC-MA09細(xì)胞株，能表達(dá)RPE65、bestrophin、MITF、Zo-1、PAX6等；黑色素含量4.1 pg/細(xì)胞，系99﹪純的RPE，不含hESC。體外試驗發(fā)現(xiàn)色素含量少的細(xì)胞(較年輕的細(xì)胞)存活與生長都較色素含量多的細(xì)胞好。動物試驗中接種至裸鼠視網(wǎng)膜下能整合入宿主組織，未形成腫瘤[1]。臨床移植時將含50000個細(xì)胞的150μl細(xì)胞懸液用結(jié)核菌素針筒注入黃斑區(qū)視網(wǎng)膜下腔。術(shù)前一周開始使用小劑量免疫抑制劑，12周后停藥。術(shù)后見到注射區(qū)的視網(wǎng)膜在數(shù)小時后即告平伏，觀察至術(shù)后4月，未發(fā)生細(xì)胞增殖，逸出移植區(qū)，眼內(nèi)炎癥，腫瘤形成或免疫排斥。兩例均為晚期患者，視力均有輕度改善[1]。Schwartz等[1]認(rèn)為hESC-RPE的優(yōu)點是可以提供無限量的較年輕的RPE，且認(rèn)為從ESC分化而得的細(xì)胞可能較少發(fā)生免疫排斥。

九、用hESC-RPE移植治療視網(wǎng)膜疾病的進(jìn)展及現(xiàn)況

該項研究是由Advanced Cell Technology公司組織的臨床試驗(Phase1/2)，從2011年4月28日至2014年1月。計劃用hESC-RPE移植治療干型AMD與Stargadt黃斑營養(yǎng)不良。進(jìn)行移植的單位除加州大學(xué)外還有Johns Hopkins大學(xué)，Wills眼科醫(yī)院，Moorefield眼科醫(yī)院等。計劃中按移植細(xì)胞量分 4期，分別為 50000，100000，150000，200000細(xì)胞/眼。Schwartz報告的是最初的二例[1]。據(jù)該公司2013年11月12日最后公布的資料，己移植了30例，第3期(150000細(xì)胞/眼)已結(jié)束，所有各例未見不良反應(yīng)[36]。但迄今尚未見到第二篇學(xué)術(shù)報告發(fā)表。在未見新的學(xué)術(shù)論文發(fā)表前，對其評價也只能以已發(fā)表的第一篇報告為準(zhǔn)[1]。

十、評論

用hESC-RPE移植治療視網(wǎng)膜疾病的初步成功，是第一次將hESC定向分化的細(xì)胞移植至人體治療疾病的報告，無疑具有重大意義。但從已有資料看也還存在一些待深入研究的問題：

1.免疫排斥：過去異體RPE移植治療干型AMD失敗的主要原因為延遲發(fā)生的免疫排斥，免疫排斥與移植細(xì)胞量有關(guān)。移植20000細(xì)胞/眼的未發(fā)生排斥，50000細(xì)胞/眼的在8～12個月才發(fā)生免疫排斥[4，8]。而本組(亦為50000細(xì)胞/眼)觀察期僅 4 月，還未到免疫排斥發(fā)生的期限[1，4，8]。因此盡管該文作者認(rèn)為從ESC分化而得的細(xì)胞可能較少發(fā)生免疫排斥，但畢竟也還是異體細(xì)胞，究竟是否會發(fā)生免疫排斥，還有待更長時間的觀察才能斷定。同時，異體RPE移植的經(jīng)驗，移植細(xì)胞達(dá)500000細(xì)胞/眼的免疫排斥更嚴(yán)重，發(fā)生也更早[4，8]。因此對本組中移植細(xì)胞量較多的 (150000～200000細(xì)胞/眼)更應(yīng)注意。

2.功能改變：hESC-RPE畢竟是實驗室中從hESC分化而得的RPE，是否能具有正常已分化的RPE的全部功能，對環(huán)境因素能否具有正常的應(yīng)變功能，能否長期的保護(hù)感光細(xì)胞及維持視功能，也還有待觀察[34]。需注意的是根據(jù)大組基因轉(zhuǎn)錄的檢測，在正常RPE的87個標(biāo)志性基因中，hESC-RPE只具其中約3/4的基因表達(dá)，還有21個基因表達(dá)異于正常胚胎RPE，這些差異可能引起的臨床改變，也值得密切監(jiān)測[34]。

3.筆者認(rèn)為hESC-RPE是較年輕的細(xì)胞，具有較好活力，為其優(yōu)點。但以往報告的異體RPE移植用的是胚胎RPE，因此這一優(yōu)點并不存在。以目前RPE的培養(yǎng)水平，提供大量年輕的正常RPE，并非難事，似無需從hESC分化取得。

4.對RPE和hESC-RPE移植前景展望：（1）AMD是與年齡相關(guān)的慢性進(jìn)行性疾病，病因未除去前，移植的RPE仍可能發(fā)生病損[4]；（2）RPE本身并無視功能，只能通過維護(hù)感光細(xì)胞間接影響視功能，同時也不可能使己死亡的感光細(xì)胞再生，至多能使瀕臨死亡，功能喪失或降低的感光細(xì)胞恢復(fù)部分功能，因此對移植后的視功能進(jìn)步，不能奢求，如能結(jié)合基因工程，增加神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌，當(dāng)有裨益[37]，目前感光細(xì)胞移植在實驗動物已取得成功[38-39]，因此先用RPE或hESC-RPE移植改善基地，隨之以感光細(xì)胞移植，才有可能大幅度改善視功能；（3）從應(yīng)用的RPE種類看，如能用從患者自身取得的iPSC或成體干細(xì)胞分化成的自體RPE(目前用iPSC分化RPE，在體外及動物試驗，均已成功[40-41])對解決免疫排斥，可能更為有利。

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