孫蓓 張東蕾 王卓實(shí) 何偉

2006年，日本Yamanaka研究小組[1]將逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc四個(gè)外源基因轉(zhuǎn)入小鼠成纖維細(xì)胞中，使成體細(xì)胞重新編程為具有多向分化潛能的干細(xì)胞，并稱為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells,iPSC）[1-3]。隨后，2007年，日本及美國的實(shí)驗(yàn)室分別又利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將人的成纖維細(xì)胞重新編程為iPSC[4]。近年來，iPSC誘導(dǎo)技術(shù)研究取得了快速的進(jìn)展，目前，除了利用病毒[4-6]、質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子[7-9]等作為載體攜帶外源基因?qū)⑷嘶蚴蟮某审w細(xì)胞重新編程為iPSC，還有實(shí)驗(yàn)室利用重組蛋白技術(shù)，小分子化合物及microRNAs等方法[10-12]獲得iPSCs。到目前為止，除成纖維細(xì)胞[1-3]以外，已有多種類型成體細(xì)胞被重編程為iPSCs，如神經(jīng)干細(xì)胞[13]、胰腺β細(xì)胞[14]、角質(zhì)形成細(xì)胞[15]、黑色素細(xì)胞[16]、血細(xì)胞[17-18]、脂肪干細(xì)胞[19-20]及尿液細(xì)胞[21]等。由體細(xì)胞誘導(dǎo)的iPSCs無論是在形態(tài)、基因和蛋白表達(dá)、表觀遺傳修飾狀態(tài)、細(xì)胞倍增能力、類胚體和畸形瘤生成能力，還是在分化能力等方面都與胚胎干細(xì)胞極為相似。此外，iPSCs可誘導(dǎo)分化成一系列特定類型的細(xì)胞，如胰島素分泌細(xì)胞[22]、神經(jīng)細(xì)胞[23-25]、肝細(xì)胞[26-27]、肌細(xì)胞[28-29]、心肌細(xì)胞[30-31]、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及感光細(xì)胞[32]等。iPSCs技術(shù)的建立被認(rèn)為是干細(xì)胞研究領(lǐng)域的一個(gè)重大發(fā)現(xiàn)和突破，由于iPSCs可來源于患者自身的體細(xì)胞，因此既可以回避干細(xì)胞治療涉及到的有關(guān)倫理道德問題，又避免了異體免疫排斥反應(yīng)，使得干細(xì)胞個(gè)體化治療成為可能，其臨床應(yīng)用前景備受關(guān)注。本綜述將著重從誘導(dǎo)多能干細(xì)胞iPSCs的重編程方法，iPSCs定向誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜細(xì)胞的方法，及其在眼科治療的應(yīng)用前景和進(jìn)展做一闡述。

一、重編程方法

目前認(rèn)為，影響產(chǎn)生可供臨床使用及安全可靠的iPSc主要因素有以下兩個(gè)：重編程方法以及被重編程細(xì)胞的來源。自2007年Thomson實(shí)驗(yàn)室[4]以及Yamanaka研究小組[1]首次編程成功人iPSCs以來，已有超過100項(xiàng)關(guān)于人iPSCs重編程方法的研究報(bào)道[33]。概括起來，現(xiàn)應(yīng)用的重編程方法大概有以下幾類：整合載體、可刪除型整合載體、非整合載體以及非轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)運(yùn)方法等。

（一）整合載體

有很多類型的整合型病毒載體被用在iPSCs的重編程過程中，其主要包括：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體以及腺病毒載體。

1.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體由于其被大家熟知的生物學(xué)特性及較高的轉(zhuǎn)染效率而被廣泛的應(yīng)用于臨床基因治療和基礎(chǔ)研究中。逆轉(zhuǎn)錄病毒是建立iPSCs過程中首個(gè)被應(yīng)用的載體，并且病毒的整合位點(diǎn)已被研究者深入而全面的研究。Yamanaka研究小組通過逆轉(zhuǎn)錄病毒將Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc四個(gè)重編程因子轉(zhuǎn)染至鼠尾成纖維細(xì)胞產(chǎn)生iPSCs，在這項(xiàng)研究中所使用的載體是以MMLV為基礎(chǔ)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，這種載體在干細(xì)胞中有自我沉默的特性，免除了對(duì)外源因子的定時(shí)撤出，但轉(zhuǎn)染效率低[1-3]。此外，Daley研究小組通過以MSCV為基礎(chǔ)的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc四個(gè)因子并聯(lián)合hTERT及SV40LT抗原成功重編程皮膚成纖維細(xì)胞為iPSCs，但是此法仍然轉(zhuǎn)染效率不高[34]。為了改善轉(zhuǎn)染效率，很多重編程方案被提出，包括Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc四因子及其他因子或者小分子的聯(lián)合應(yīng)用。逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)運(yùn)方法的重編程效率部分的依賴于成體細(xì)胞的類型。近年研究發(fā)現(xiàn)，在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的iPSCs重編程過程中，上皮細(xì)胞源性的iPSCs重編程比MEF(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)源性的iPSCs重編程過程要容易很多[15]。逆轉(zhuǎn)錄病毒有整合附近起始位點(diǎn)的傾向及易導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化的結(jié)果，所以在未來臨床應(yīng)用方面的價(jià)值還值得商榷。

2.慢病毒載體：慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒的子集，能夠感染分裂期細(xì)胞及非分裂期細(xì)胞，并能整合進(jìn)基因組。此外，慢病毒同逆轉(zhuǎn)錄病毒相比的另一個(gè)的優(yōu)勢(shì)是，它能轉(zhuǎn)錄大片段的基因組。近期有實(shí)驗(yàn)者將重編程的Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc四個(gè)因子轉(zhuǎn)運(yùn)至多順反子慢病毒的單一構(gòu)造中，代替了先前四個(gè)各攜帶一個(gè)基因的相互分離的載體，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，來自于單個(gè)載體整合的iPSCs不僅能將因插入外源基因而產(chǎn)生的突變最小化，而且能提高轉(zhuǎn)染效率[35-36]。但是慢病毒重編程方法有一個(gè)潛在的缺陷，當(dāng)iPSCs分化成各種類型細(xì)胞時(shí)，重編程的因子會(huì)經(jīng)常被再次激活，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的形成。

（二）可刪除的整合載體

作為下一步更具安全性的改進(jìn)方案，可刪除性的整合載體被設(shè)計(jì)出來，目的是為了產(chǎn)生非轉(zhuǎn)基因的iPSCs及避免整合載體帶來的潛在性致瘤作用。

1.病毒源性可刪除載體：Jaenish研究小組近期設(shè)計(jì)出包含有可用最小限度強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)表達(dá)的CMV啟動(dòng)子及一個(gè)在3’LTR的loxP位點(diǎn)的慢病毒載體。使用這個(gè)系統(tǒng)，重編程因子能夠在細(xì)胞Cre重組酶的表達(dá)下被切割移除。另外，Jaenish的研究資料表明，非轉(zhuǎn)基因iPSCs能夠維持潛能性階段，并且全基因的表達(dá)譜數(shù)據(jù)同ES細(xì)胞很接近[37]。但是這個(gè)研究的主要缺陷是會(huì)導(dǎo)致基因重排及基因組的不穩(wěn)定。為了克服這一缺點(diǎn)，Townes的研究小組使用了多順反子的慢病毒載體進(jìn)行iPSCs的重編程，但是所產(chǎn)生的iPSCs依然含有插入位點(diǎn)，因此從遺傳學(xué)角度來看依舊不能稱之為完全的多潛能性干細(xì)胞[38]。

2.轉(zhuǎn)座子源性的可刪除載體：轉(zhuǎn)座子（transposon）是一個(gè)非固定的基因單位，可以在單個(gè)細(xì)胞的基因組中從一個(gè)位點(diǎn)轉(zhuǎn)移至不同的位點(diǎn)，能夠?qū)е禄虻闹嘏偶巴蛔?。Kaji及其合作者利用piggyback(PB)系統(tǒng)高效的將成纖維細(xì)胞重編程為iPSCs，這些iPSCs中瞬時(shí)表達(dá)的轉(zhuǎn)座酶可切除引入的外源基因，但不引起細(xì)胞基因組DNA序列的變化[39]。另外一個(gè)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)是Sleeping Beauty(SB)系統(tǒng)，Dinnyes小組利用該系統(tǒng)使用Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc四個(gè)因子分別將ICR遠(yuǎn)交群小鼠、C57BL/6-近交群小鼠以及C57BL/6 x DBA/2J產(chǎn)生的小鼠這三類不同基因背景小鼠的成纖維細(xì)胞成功編程為iPSCs[40]。其產(chǎn)生iPSCs的效率同PB系統(tǒng)類似，但是整合和刪除過程同PB系統(tǒng)相比并不完全可靠[41]。

（三）非整合載體

為了避免在重編程過程中宿主細(xì)胞基因組被干擾，安全性更高的重編程方案被進(jìn)一步提出。

1.病毒型非整合載體：Stadtfeld利用腺病毒載體轉(zhuǎn)染Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc四個(gè)因子至成體肝細(xì)胞，將其重編程為非整合的iPSCs，但是轉(zhuǎn)染效率很低，只有0.0006﹪[42]。而最近Zhou的研究小組利用腺病毒轉(zhuǎn)染Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc四個(gè)因子至人的成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生iPSCs的效率依舊非常低[43]。大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腺病毒不太具有轉(zhuǎn)運(yùn)多個(gè)因子至同一個(gè)細(xì)胞的能力，且整合進(jìn)細(xì)胞基因組中的可能性較小，可于供體細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子，易于獲得無毒害副作用的或無病毒載體整合的iPSCs，但重編程iPSCs的效率較逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒方法低許多，需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)轉(zhuǎn)染。

2.質(zhì)粒載體：Yamanaka研究小組通過在第1、3、5、7天瞬時(shí)轉(zhuǎn)染環(huán)狀質(zhì)粒表達(dá)的因子至MEF細(xì)胞而得到了iPSCs。建立起的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系在細(xì)胞形態(tài)學(xué)同ES細(xì)胞極其相似，并且在ES細(xì)胞潛能性標(biāo)記物的表達(dá)上保持相似的水平。另外，這些細(xì)胞不含有載體并且非整合[44]。Gonzalez的研究小組通過反復(fù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染一個(gè)編碼有Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc四個(gè)因子的單獨(dú)的多順反子載體將MEF細(xì)胞重新編程為iPSCs，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示這些細(xì)胞不含有轉(zhuǎn)入基因的整合[45]。但是通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)行重編程的效率被認(rèn)為低于逆轉(zhuǎn)錄病毒及慢病毒的轉(zhuǎn)染效率。

3.附著體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：附著體載體，例如以EBNA1為基礎(chǔ)的附著體載體，能夠在分裂期及非分裂期細(xì)胞中作為染色體外元件自發(fā)的自我復(fù)制且不整合于基因組中。因?yàn)樵谀康募?xì)胞中重編程因子的持續(xù)增強(qiáng)表達(dá)，使其同傳統(tǒng)的質(zhì)粒載體相比更具有優(yōu)越性。Yu的研究小組利用三個(gè)獨(dú)立的oriP/EBNA1附著體載體，將Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nango,Lin28及SV40LT七個(gè)因子用不同的組合形式放置于CMV和EF1啟動(dòng)子的下游，成功將人包皮成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染成iPSCs[46]。另外，Chou的研究小組使用了編碼有Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc以及Lin28五種因子的單獨(dú)的多順反子oriP/EBNA1附著體載體系統(tǒng)成功將人外周血細(xì)胞重編程為iPSCs，并且轉(zhuǎn)染效率同其他附著體載體相比提高了10～100倍[47]。近期Meng等[48]利用oriP/EBNA1附著體載體，僅使用Oct3/4，Sox2兩種因子及SFFV啟動(dòng)子，使2﹪的臍帶血CD34+細(xì)胞成功轉(zhuǎn)化為iPSCs。并且研究者注意到重編程的效率同Oct3/4，Sox2兩種因子的表達(dá)密切相關(guān)，因此Meng等[48]設(shè)計(jì)了一個(gè)含有Wpre元件的附著體載體，使用這個(gè)改良后的載體，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)率增加了50﹪，僅使用Oct3/4，Sox2兩種因子高效的產(chǎn)生了無轉(zhuǎn)基因的iPSCs。隨后該研究小組利用oriP/EBNA1 附著體載體，使用 Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc及BCL-XL五個(gè)因子成功將成人外周血細(xì)胞重編程為iPSCs，并且重編程效率也有明顯提高[49]。而此項(xiàng)研究結(jié)果為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞庫，疾病模型及再生醫(yī)學(xué)提供潛在的應(yīng)用。

（四）非轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)運(yùn)方法

為避免因基因插入帶來的突變或致瘤性，非轉(zhuǎn)基因重編程成體細(xì)胞的方法被提出。

1.重組蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)：這個(gè)以重組蛋白為基礎(chǔ)的方法能夠避免因整合外源DNA而引起的插入突變。Zhou等[10]純化了重編程因子翻譯的重組蛋白，再將其與細(xì)胞穿膜肽形成融合蛋白，穿透細(xì)胞膜而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，在丙戊酸(Valproic acid，VPA)的配合作用下獲得了小鼠胚胎成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的iPSCs，人的成纖維細(xì)胞也通過類似的方法(沒有使用VPA)獲得了iPSCs。但是重編程的持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)且效率偏低，重編程效率不到0.001﹪。

2.小分子轉(zhuǎn)運(yùn)法：鄧宏魁的研究小組利用FSK、VPA、CHIR、616452、Tranyl、DZNep、TTNPB等七種小分子組合，成功將小鼠MEF細(xì)胞重編程為iPSCs。所獲得的iPSCs在倍增時(shí)間及潛能性標(biāo)記物的表達(dá)上同ES細(xì)胞非常相似。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，可通過小分子非特異性調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)分子信號(hào)通路，代替主控基因進(jìn)行細(xì)胞的重編程。但是小分子的方式重編程效率仍舊不高[50]。

3.microRNAs(miRNAs)：近年的研究發(fā)現(xiàn)，幾個(gè)microRNAs(miRNAs)的單獨(dú)表達(dá)連同OSKM四因子協(xié)同作用于細(xì)胞的重編程過程中時(shí)，能夠增強(qiáng)細(xì)胞的重編程效率[51]。這些miRNAs屬于優(yōu)先表達(dá)在胚胎干細(xì)胞的miRNAs家族，被認(rèn)為能夠幫助維持ES細(xì)胞的表型。Morrisey的研究小組近期發(fā)現(xiàn)，miR302/367簇能夠更快速及有效的重編程鼠及人的成體細(xì)胞，并且這一過程不需要任何外源性的轉(zhuǎn)錄因子的加入。miR302/367簇由五個(gè)miRNAs組成，其中四個(gè)是miR302a/b/c/d，含有同一個(gè)種子序列。研究發(fā)現(xiàn)miR302/367簇的表達(dá)水平同Oct3/4在ES細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄及早期胚胎發(fā)育相關(guān)，這提示其在ES細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和干性的維持的重要作用。此項(xiàng)研究提出了一個(gè)非病毒，無轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的產(chǎn)生iPSCs的新方法，這不僅可以用于干細(xì)胞生物的基礎(chǔ)研究，并且能夠用于患者來源的高效率iPSCs產(chǎn)生的臨床研究[52]。

二、iPS細(xì)胞重編程過程中成體細(xì)胞的來源

理論上，各種類型的成體細(xì)胞都有可能被重新編程為iPSCs。目前，已有許多類型成體細(xì)胞可以被重新編程為iPSCs，如人和鼠的成纖維細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、胰腺β細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、血細(xì)胞脂肪干細(xì)胞及尿液細(xì)胞等。但是要選擇一種提取過程簡(jiǎn)單、編程時(shí)間短以及誘導(dǎo)效率高的體細(xì)胞，以便可以更好的研究iPSCs。當(dāng)前發(fā)表的文章中研究最多的是成纖維細(xì)胞，這種細(xì)胞最大的優(yōu)點(diǎn)就是容易在體外進(jìn)行培養(yǎng)，但是缺點(diǎn)是從患者身體獲得細(xì)胞時(shí)需要組織活檢或者外科手術(shù)的形式，諸如麻醉、切口、縫合，這些不僅不方便，而且有痛苦同時(shí)還會(huì)帶來潛在性的并發(fā)癥，包括感染等。除此之外，它獲得iPSCs的效率也比較低[53]。神經(jīng)干細(xì)胞用來產(chǎn)生iPSCs是一種較好的且編程較簡(jiǎn)單的備選細(xì)胞，并且可以作為iPSCs的移植、藥物研發(fā)和人類疾病機(jī)制研究的理想模型，它被重新編程為iPSCs僅需要一種或兩種因子誘導(dǎo)[13]，但是獲得神經(jīng)干細(xì)胞比較復(fù)雜，并不能作為穩(wěn)定的細(xì)胞資源。角質(zhì)形成細(xì)胞因其高表達(dá)內(nèi)源性c-Myc基因，所以用于產(chǎn)生iPSCs時(shí)很容易獲得，雖然與成纖維細(xì)胞相比，重新編程的效率提高了一百倍，速率提高了兩倍[15]，但其在體外培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)。臍帶血細(xì)胞可重新編程為iPSCs，且僅用兩種因子Oct3/4和Sox2[18]。Amanda研究小組使用改良后的oriP/EBNA1附著體載體，使2﹪的臍帶血CD34+細(xì)胞成功轉(zhuǎn)化為iPSCs，大大提高了重編程效率，主要原因歸功于改良后附著體載體的設(shè)計(jì)優(yōu)勢(shì)，這種改良后的附著體含有SFFV啟動(dòng)子以及Wpre元件。SFFV啟動(dòng)子在造血細(xì)胞中可以驅(qū)使轉(zhuǎn)基因有更高水平的表達(dá)；Wpre元件是一個(gè)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件，一般用于慢病毒載體以改進(jìn)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。在此研究結(jié)果中，Wpre元件使得轉(zhuǎn)基因表達(dá)增加了50﹪，據(jù)此提高了細(xì)胞的重編程效率[48]。此外外周血中獲得的CD34+細(xì)胞也可以編程為iPSCs，Amanda等利用oriP/EBNA1附著體載體，使用 Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc及 BCL-XL五個(gè)因子成功將成人外周血細(xì)胞重編程為iPSCs，且同之前的重編外周血的CD34+細(xì)胞誘導(dǎo)效率相比明顯提高，主要原因有兩個(gè)：（1）實(shí)驗(yàn)者使用了改良的附著體載體，這種載體使用了SFFV啟動(dòng)子；（2）在重編程過程中加入BCL-XL，使之與Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc四個(gè)因子聯(lián)合應(yīng)用。BCL-XL有抗凋亡的作用，可以使細(xì)胞的生存率增加，導(dǎo)致重編程因子的異常表達(dá)。并且BCL-XL的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致黏附分子表達(dá)的上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附，進(jìn)而提高細(xì)胞重編程效率[49]。Utikal首次將黑色素細(xì)胞重新編程為iPSCs，由于它可以高表達(dá)內(nèi)源性的Sox2，所以用Oct3/4、c-Myc和Klf4可將黑色素細(xì)胞重新編程為iPSCs[16]，并且其轉(zhuǎn)染效率高可達(dá)到0.05﹪，轉(zhuǎn)染速度更快，只有10d左右。脂肪干細(xì)胞可在無飼養(yǎng)層的條件下重新編程為iPSCs，它較易獲得且數(shù)量較多，脂肪干細(xì)胞是異質(zhì)性多能祖系細(xì)胞，可以分化為多種細(xì)胞系，包括骨、軟骨、肌肉和脂肪組織[19-20]。胰腺β細(xì)胞可編程為iPSCs，這為一些糖尿病患者提供了新的治療方法，而且產(chǎn)生患者特異性的iPSCs，特異性的iPSCs可定向分化為分泌胰島素細(xì)胞，再將這些細(xì)胞移植回患者體內(nèi)，不僅避免了免疫排斥反應(yīng)，還解決了供體資源短缺的問題[14]。最近，裴端卿及其研究小組通過構(gòu)建一個(gè)表達(dá)miR302/367簇的附著體載體并同時(shí)轉(zhuǎn)染了 Oct3/4、Sox2、Klf4、SV40T四個(gè)因子，成功將尿液細(xì)胞重編程為iPSCs，結(jié)果顯示，尿液細(xì)胞比成纖維細(xì)胞更容易被重編程[21]。這項(xiàng)研究結(jié)果為未來更深一步的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。首先，裴端卿研究小組尿液細(xì)胞重編程的過程中在無飼養(yǎng)層細(xì)胞，無病毒，沒有c-Myc因子的條件下產(chǎn)生iPSCs，為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)；其次，尿液來源的細(xì)胞取材完全沒有侵入性，尤其適合兒童及一些特殊疾病的患者，比如血友??；最后，尿液細(xì)胞顯示上皮細(xì)胞的表型，通過繞過間葉細(xì)胞向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化這一過程，比皮膚間充質(zhì)成纖維細(xì)胞更容易被重編程為iPSCs。從以上重編程的體細(xì)胞的細(xì)胞來源來看，血細(xì)胞取材方便，來源較穩(wěn)定；尿液細(xì)胞取材沒有侵入性，方便獲得，因此受到研究者越來越多的關(guān)注。

不同來源的細(xì)胞在重編程為iPSCs時(shí)都有自身的有利性及局限性。表1對(duì)目前不同重編程方法及被重編程的體細(xì)胞做了一個(gè)概括性的總結(jié)。近期的研究顯示iPSCs在細(xì)胞特性和分化潛能上，顯示出顯著的基因影響及表觀性記憶，而這些都依賴于來源體細(xì)胞的類型[54]。如果這一結(jié)果被更

多的研究進(jìn)一步的證實(shí)，那么未來針對(duì)患者特異iPSCs產(chǎn)生所需的最佳細(xì)胞來源的選擇，則需要更為慎重的考慮。

表1 不同誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的重編程方法比較

三、iPSCs分化成視網(wǎng)膜細(xì)胞

iPSCs有自發(fā)向視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞（RPE）分化的傾向。2009年，DENNIS O.CLEGG研究小組利用Oct3/4、Sox2、Nanog以及Lin28四個(gè)因子重編程成纖維細(xì)胞，得到了iPSCs后經(jīng)過自發(fā)分化成為RPE細(xì)胞，盡管通過自分化后的RPE細(xì)胞在第4～5代后其色素上皮的表型會(huì)逐步減弱，但是在前兩代的RPE細(xì)胞和經(jīng)由胚胎干細(xì)胞分化的RPE細(xì)胞以及人類胎兒的RPE細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、基因及蛋白表達(dá)，桿外節(jié)吞噬作用上都及其相似，這說明iPSCs能自分化成為有功能性的RPE細(xì)胞[55]。同年，Masayo Takahashi小組使用酪蛋白激酶1抑制劑CKI-7、ALK4抑制劑SB-431542，以及Rho相關(guān)激酶抑制劑Y-27632等小分子在無血清無飼養(yǎng)層的懸浮培養(yǎng)條件下將hiPSCs誘導(dǎo)分化為RPE及感光細(xì)胞[39]。并且為了建立分化細(xì)胞最終成品的未分化殘余hiPSCs的高靈敏度測(cè)定，2012年，Masayo Takahashi小組使用傳代后第三代及第四代的純化hiPSCs-RPE進(jìn)行了三個(gè)體外檢測(cè)：軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)，流式分析以及qRT-PCR。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，使用Lin28作為目標(biāo)基因的qRT-PCR能夠成功檢測(cè)出hiPSCs-RPE中0.002﹪的hiPSCs殘余[56]，這為未來臨床應(yīng)用的安全監(jiān)察提供了一個(gè)有效手段。

在體外實(shí)驗(yàn)方面，Amanda-Jayne Carr研究小組將hiPSCs-RPE的細(xì)胞懸液通過視網(wǎng)膜下途徑移植至RCS大鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示了一個(gè)短期的細(xì)胞存活及光感受器的維持[57]，主要原因可能有：(1)RPE細(xì)胞是黏附的單層細(xì)胞，移植時(shí)需要一個(gè)適當(dāng)?shù)酿じ交|(zhì)；(2)RPE細(xì)胞有可能聚集成團(tuán)，無法形成單層結(jié)構(gòu)。最近Masayo Takahashi小組通過一個(gè)新的裝置，包括一個(gè)處理過的扁平的20號(hào)導(dǎo)管同一個(gè)定制的活塞將一個(gè)1.3 mm×3.0 mm的hiPSCs-RPE-sheet經(jīng)過視網(wǎng)膜下途徑移植至兔眼內(nèi)，而這個(gè)方法更為安全和穩(wěn)定[58]。

除此之外，Meyer小組通過利用慢病毒表達(dá)Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28，成功將一位患有回旋型萎縮的患者皮膚成纖維細(xì)胞重新編程為iPSCs?；匦晕s是一種罕見的常染色體隱形遺傳的視網(wǎng)膜退行性病變，主要影響RPE細(xì)胞，導(dǎo)致光感受器的丟失及最終致盲。實(shí)驗(yàn)者將iPSCs經(jīng)過誘導(dǎo)分化，最終得到了特異性疾病的功能缺失的RPE細(xì)胞，并且通過基因靶向修復(fù)手段修復(fù)其缺陷基因，使之發(fā)育成為功能正常的色素上皮細(xì)胞。這項(xiàng)研究的意義不僅在于能夠進(jìn)一步加深對(duì)人體視網(wǎng)膜發(fā)展及相應(yīng)疾病的研究，也提出了人類iPSCs在患者個(gè)體化治療方面的巨大應(yīng)用前景[59]。隨后，Phillip等[60]通過以MMLV為基礎(chǔ)的逆轉(zhuǎn)錄病毒，表達(dá) Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28，成功將人外周血T淋巴細(xì)胞重編程為iPSCs，繼而進(jìn)行誘導(dǎo)分化形成視網(wǎng)膜細(xì)胞。這項(xiàng)研究成果不僅證明由血細(xì)胞來源的iPSCs能夠產(chǎn)生視網(wǎng)膜細(xì)胞，也為基于iPSCs的視網(wǎng)膜研究提供了一個(gè)更為方便的供體細(xì)胞來源。近期Masayo Takahashi等人利用Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc四因子通過仙臺(tái)病毒重編程至視網(wǎng)膜色素變性（RP）患者的皮膚成纖維細(xì)胞中，得到非整合型iPSCs，隨后又通過無血清的，化學(xué)組成成分明確的培養(yǎng)基進(jìn)行逐步分化，繼而得到了神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞，視網(wǎng)膜色素上皮祖細(xì)胞，光感受器前體細(xì)胞，色素上皮細(xì)胞及光感受器細(xì)胞。經(jīng)過連續(xù)培養(yǎng)后，視桿細(xì)胞的數(shù)量急劇減少，這提示了一個(gè)視網(wǎng)膜桿狀細(xì)胞退化的體外模型的形成。研究者由此，通過RP患者皮膚成纖維細(xì)胞產(chǎn)生非整合iPSCs，并通過逐步誘導(dǎo)分化得到了視網(wǎng)膜桿狀細(xì)胞退化的體外模型，概述了RP的疾病特征以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在RP發(fā)生時(shí)的機(jī)制[61]。這一研究顯示了iPSCs在體外疾病模型研究中的實(shí)用性。

四、iPScs在眼科臨床應(yīng)用的進(jìn)展及前景

iPSCs技術(shù)的建立被認(rèn)為是干細(xì)胞研究領(lǐng)域的一個(gè)重大發(fā)現(xiàn)和突破，由于iPSCs來源于患者自身的體細(xì)胞，將iPSCs應(yīng)用到臨床干細(xì)胞治療既回避干細(xì)胞治療涉及到的有關(guān)倫理道德問題，又避免異體免疫排斥反應(yīng)，使得干細(xì)胞個(gè)體化治療成為可能，其臨床應(yīng)用前景備受關(guān)注。

日本近日批準(zhǔn)了利用iPSCs開展視網(wǎng)膜再生的臨床研究，這是世界上首個(gè)即將進(jìn)行的iPSCs臨床試驗(yàn)。新批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)是從濕性老年黃斑變性患者前臂采集4 mm的皮膚組織，誘導(dǎo)成為iPSCs，進(jìn)而分化成為色素上皮細(xì)胞，發(fā)育成為薄片狀后移植入患者的黃斑受損區(qū)。研究者之所以會(huì)選擇這種眼病進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)，是由于視網(wǎng)膜細(xì)胞不易癌變，即便癌變也容易與正常組織區(qū)分，并可用激光燒灼治療。并且，由于只需要向約2 mm見方的區(qū)域移植色素上皮細(xì)胞，移植部分便可從外部辨別是否異常，觀察更加方便[62]。該項(xiàng)目進(jìn)入臨床的準(zhǔn)備周期需要大概十個(gè)月的時(shí)間，因此2014年會(huì)進(jìn)入臨床實(shí)踐。

盡管iPSCs在眼科臨床應(yīng)用方面有著誘人的前景，但是目前還有一系列問題亟待解決：（1）重編程成體細(xì)胞的細(xì)胞來源選擇，盡管現(xiàn)在很多類型的成體細(xì)胞能夠被重新編程為iPSCs，但是應(yīng)用到臨床中還需考慮到以下方面：細(xì)胞取材是否容易，能否保證來源，編程時(shí)間長(zhǎng)短，以及重編程的效率高低等；（2）如何提高iPSCs誘導(dǎo)效率及安全性，iPSCs的重編程效率總體來說依舊不盡如人意，并且很多重編程方案也不能完全排除細(xì)胞的突變及致瘤性，因此還需尋找更為安全及高效的方法；（3）如何提高iPSCs誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜細(xì)胞的效率，就目前研究來看，各種方法誘導(dǎo)iPSCs分化成視網(wǎng)膜細(xì)胞的周期都偏長(zhǎng)，使得臨床治療的周期也相對(duì)加長(zhǎng)；（4）如何保障移植前細(xì)胞的純度及安全性檢測(cè)，為了避免移植過程中帶入未分化或者分化誘導(dǎo)不完全的iPSCs，需要更為可靠的安全檢測(cè)。隨著iPSCs重編程機(jī)制的闡明，以及干細(xì)胞在臨床應(yīng)用研究的不斷進(jìn)步，相信不久的將來利用iPSCs的干細(xì)胞個(gè)體化治療技術(shù)必將造福于人類。

表2 iPSc分化成視網(wǎng)膜細(xì)胞

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