李遠(yuǎn)輝，李希,，馮建安，武亞曉，吳瑩

美洲大蠊(Periplaneta americanaL.) 為昆蟲綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲，俗稱“蟑螂”，始載于《本草經(jīng)》，味咸，性寒，有散瘀、化積、解毒等功效，主治癥瘕積聚、小兒疳積喉痹、乳蛾、癰瘡腫毒、蟲蛇咬傷等病癥,是一種傳統(tǒng)藥用昆蟲[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，美洲大蠊具有促進血管增生、組織修復(fù)，強心升壓、改善微循環(huán)，抗菌抗炎、抗病毒、抗腫瘤，增強免疫等作用[2]。目前，對美洲大蠊的活性研究多集中在抗腫瘤，治療肝炎、心血管疾病等方面[3]，但抑菌活性的相關(guān)研究文獻報道較少。本研究通過體外抑菌實驗，研究美洲大蠊不同提取部位對3種受試菌種(金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌) 的體外抑菌活性，明確其最低抑菌濃度( MIC)和最低殺菌濃度(MBC),確定其抑菌活性部位，為進一步的抑菌活性成分研究提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗藥物

美洲大蠊（湖南科倫制藥有限公司提供，批號：130826)。

1.2 試劑

銅綠假單胞菌[CMCC(B)10 104]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]、大腸埃希菌[CMCC(B)44 102]中國藥品生物制品檢定所提供；MH 瓊脂培養(yǎng)基(批號:110717)，MH 肉湯培養(yǎng)基(批號:120728) 成都生物制品檢定所提供；DMSO（批號：870207，天津市化學(xué)試劑一廠）。

1.3 儀器

立式滅菌器(型號:YX280A，上海三申醫(yī)療器械有限公司），電子天平(型號: BT125D,德國Sartorius公司)，DNP-9162 電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 供試品溶液的制備 取美洲大蠊粗粉2000 g，用95%乙醇回流提取3次，每次1小時，合并提取液，濾過，濾液減壓旋蒸得95%乙醇浸膏900 g，留20 g用于配制95%乙醇提取部位供試品溶液。剩余乙醇浸膏用水混懸，采用系統(tǒng)溶劑萃取法分級萃取，用等體積的石油醚、乙酸乙酯、水飽和的正丁醇萃取并濃縮得石油醚浸膏，乙酸乙酯浸膏，正丁醇浸膏。分別取95%醇浸膏、石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏和正丁醇浸膏，用吐溫-80溶解,制成每升含相當(dāng)于800 g原生藥的溶液, 用0.22 μm的無菌過濾器除菌后，作為供試品溶液，保存至4 ℃冰箱備用。

1.4.2 菌懸液的制備 將3種受試標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種于M-H瓊脂培養(yǎng)基平板上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別用無菌生理鹽水將菌苔洗下并校正菌液濃度，使其相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，再用M-H肉湯培養(yǎng)基分別稀釋至含菌量約為1×106CFU．L-1，即為受試菌種的菌懸液，稀釋后的菌懸液在15 min內(nèi)接種。

1.4.3 體外抑菌實驗 采用試管二倍稀釋法聯(lián)合瓊脂平板法[4]。

1.4.4 供試藥物的抑菌試驗 取12支無菌小試管為一組，每支試管分別加入M-H肉湯培養(yǎng)基2 mL。取供試品溶液，用吸管吸取藥液2 mL置第1管內(nèi)，混勻后吸取2 mL置第2管內(nèi)，同樣混勻后吸出2 mL置第3管內(nèi)。依此法逐管進行稀釋至第12管。使各管藥物濃度分別為400，200，100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.56，0.78，0.39，0.195 g．L-1，各管均加入菌懸液0.1 mL。各供試品溶液按此法做3組平行實驗。

1.4.5 對照實驗 取5支無菌小試管為一組，分別標(biāo)記“肉湯對照”、“溶劑對照”、“金黃色葡萄球菌對照”、“大腸埃希菌對照”、“銅綠假單胞菌對照”。除“肉湯對照”管外其余各管均加入M-H肉湯2 mL和相應(yīng)菌懸液0.1 mL。做3組平行試驗。

將以上所有試管于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察并記錄實驗結(jié)果。在各對照管符合要求的前提下，以肉眼未見生長的最低藥物濃度為美洲大蠊各提取部位對受試菌種菌的MIC。再從未見細(xì)菌生長的試管中取1 mL于M-H瓊脂培養(yǎng)基的瓊脂平板上作次代培養(yǎng)，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察并記錄實驗結(jié)果，以不生長菌落的最低藥物濃度為美洲大蠊各提取部位對受試菌種的MBC。

2 結(jié)果

2.1 供試藥物的抑菌試驗

美洲大蠊石油醚提取部位的抑菌活性最強，對三種受試菌種均有抑菌作用， MIC為1.56～6.25 g．L-1，MBC為1.56～12.5 g．L-1；美洲大蠊乙酸乙酯提取部位對銅綠假單胞菌有抑菌作用，MIC為25 g．L-1，MBC為50 g．L-1；而正丁醇提取部位及95%乙醇提取部位無明顯抑菌作用。結(jié)果見表1。

2.2 對照實驗

“肉湯對照”組無菌落長出,“溶劑對照”組對三種受試菌種無抑菌作用,“金黃色葡萄球菌對照”、”大腸埃希菌對照”、“銅綠假單胞菌對照”各標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)后菌落個數(shù)相當(dāng)。各對照管符合要求。

3 討論

抗生素投入臨床使用以來，至今已有70多年的歷史。隨著全球抗生素的濫用，不斷涌現(xiàn)的耐藥菌甚至超級耐藥菌使得細(xì)菌感染性疾病再次成為困擾人類的難題[6]。發(fā)掘新的抗耐藥菌感染的抗菌藥物成為人類重大課題。而在中藥抗感染治療中, 細(xì)菌對抗感染中藥及其復(fù)方不易產(chǎn)生耐藥性, 且部分中藥具有延緩、消除耐藥性的現(xiàn)象, 增加了對抗細(xì)菌耐藥性的措施與策略[7]。本實驗對美洲大蠊進行系統(tǒng)的體外抑菌活性研究，以期為開發(fā)中藥抗菌藥、攻克細(xì)菌耐藥性的研究提供一條新思路。

金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及銅綠假單胞菌在創(chuàng)面細(xì)菌性感染中占了很大比例[8～9]，致病性強同時又表現(xiàn)出多重耐藥性，給臨床后期治療帶來了很大的困難。故本研究選以上3種菌株作為抑菌活性篩選載體，能更好的評價美洲大蠊藥材不同提取部位的抑菌活性。

本研究結(jié)果表明，美洲大蠊最有效抑菌部位為石油醚提取部位，提示美洲大蠊所含的抑菌活性成分在石油醚提取部位的分布較集中，可能為同一類化學(xué)成分，這為美洲大蠊進一步的抑菌活性成分研究提供了參考依據(jù)。目前被開發(fā)利用的主要為美洲大蠊藥材的乙醇、水提取部位，如“康復(fù)新”、“心脈隆”、“肝龍膠囊”等系列藥，若加大對美洲大蠊低極性部位的抑菌活性的研究開發(fā)，對于臨床上治療各種致病菌感染具有重要意義。

[1] 南京中藥大學(xué).中藥大辭典,第2版[M].上海:上?？萍汲霭嫔?2006:3784.

[2] 王奎,馮穎,孫龍,等.美洲大蠊乙酸乙酯提取物的分離和抑菌活性分析[J].林業(yè)科學(xué)研究,2013,26(2):164.

[3] 李洪文,耿玲,劉光明,等.美洲大蠊脫脂膏及其活性炭脫色物體外抗菌活性研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2012,18(11):161.

[4] 洪小鳳,王濤,施貴榮,等.隔山消不同極性提取物抗菌作用實驗研究[J].中成藥,2011,33(6):1053.

[5] 丘仲柳,曾鳳群.外科感染創(chuàng)面病原菌分布及其耐藥性分析[J].海南醫(yī)學(xué),2010,(19):106.

[6] 孫紅,薛越,黃寧.抗菌肽抗菌機制的研究進展[J].中國抗生素雜志,2013,38(8):568.

[7] 李睿明,雷朝霞.細(xì)菌耐藥性對抗策略[J].醫(yī)學(xué)與哲學(xué),2006,27(8):45.

[8] 吳德華,李培富,邵強,等.安信納米燒燙傷貼抑制頑固感染創(chuàng)面細(xì)菌生長的效果[J].實用醫(yī)藥雜志,2002,19(8):622.

[9] 張凱,朱家源,唐冰,等.慢性創(chuàng)面的病原菌調(diào)查分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2012,22(1):2456.