劉笛秋

（湖南省益陽市赫山區(qū)畜牧水產(chǎn)局，湖南益陽 413002）

豬繁殖與呼吸綜合征檢測方法及其中草藥防治的綜述

劉笛秋

（湖南省益陽市赫山區(qū)畜牧水產(chǎn)局，湖南益陽 413002）

豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起，以繁殖母豬出現(xiàn)繁殖障礙、早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎和木乃伊胎，仔豬呼吸綜合征為特征的高度接觸性傳染病。本文綜述了豬繁殖與呼吸綜合征的RT-PCR和ELISA兩種檢測方法、中草藥添加劑對豬繁殖與呼吸綜合征的防治作用，以期為養(yǎng)豬者在生產(chǎn)中檢測和防控PRRS起到參考作用。

PRRS；RT-PCR；ELISA；中草藥添加劑

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）俗稱“藍(lán)耳病”，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起，臨床上主要表現(xiàn)為體溫明顯升高、眼結(jié)膜炎、眼瞼水腫、咳嗽、氣喘，部分豬只表現(xiàn)為后軀無力、不能站立或共濟失調(diào)等神經(jīng)癥狀。繁殖母豬出現(xiàn)繁殖障礙、早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎和木乃伊胎，可造成30%以上的流產(chǎn)率；仔豬表現(xiàn)為呼吸綜合征，仔豬發(fā)病率高達(dá)100%，死亡率也達(dá)50%以上。

PRRSV為一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，具有高度的變異性。目前我國分離得到的毒株主要來源于RNA序列存在50%～70%相似度的歐洲毒株（Lelystad病毒）和北美洲毒株（VR-2332）兩個原型。PRRSV可以水平傳播和垂直傳播，康復(fù)豬也可以在恢復(fù)過程中的2～3個月持續(xù)通過分泌物、糞便、尿液等向外排毒，飼養(yǎng)環(huán)境、人員、轉(zhuǎn)運等都可以成為病毒的傳播途徑。我國2006—2007年的養(yǎng)豬業(yè)遭受過PRRS的大流行，造成了巨大的經(jīng)濟損失，隨著滅活苗和弱毒活疫苗的使用，目前已得到較好的控制，僅在局地還有流行，但仍不可對此掉以輕心。

本文綜述了PRRS的RT-PCR和ELISA兩種檢測方法、中草藥添加劑對PRRS的防治作用，以期為養(yǎng)豬者在生產(chǎn)中檢測和防控PRRS起到參考作用。

1 PRRSV的檢測

1.1 反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測

RT-PCR是目前公認(rèn)的檢測PRRSV最為快捷、有效的方法，主要包括常規(guī)RT-PCR、套式RT-PCR和實時熒光定量RT-PCR等，這三種方法各有優(yōu)缺點。常規(guī)RT-PCR能夠特異、敏感地檢測出樣品中的PRRSV；套式RT-PCR使用兩對引物進(jìn)行脫氧核糖核酸片段的特異性擴增，在特異性和敏感性上有很大提高；而實時熒光定量RT-PCR利用了熒光信號的積累，實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，不僅實現(xiàn)了對脫氧核糖核酸模板的定量，而且其敏感度、特異性和可靠性更高，自動化程度高，具有無污染、實時性和準(zhǔn)確性高等特點[1-3]。

試驗研究也證實，RT-PCR是一種快捷、有效、可靠的檢測PRRSV的方法。郝曉芳等[4]建立了一種PRRSV的RT-PCR檢測方法，該方法擴增高致病性PRRSV基因組時，可獲得230 bp的片段，擴增經(jīng)典型PRRSV時，則獲得320 bp的片段，根據(jù)RT-PCR產(chǎn)物大小可將二者區(qū)分開來。通過大量臨床病料的檢測，并配合PCR產(chǎn)物測序驗證，結(jié)果表明該方法簡便、快速、特異，可以鑒別高致病性PRRSV，為進(jìn)一步的PRRS流行病學(xué)研究提供了重要的技術(shù)手段。安春霞等[5]以高致病性和低致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HP/LPPRRSV）混合物總RNA為反轉(zhuǎn)錄模板，成功建立了HP-PRRSV和LP-PRRSV二重RT-PCR檢測方法，該方法靈敏度高，最低檢出限均為100拷貝/μL；重復(fù)性好，特異性強，可特異性地擴增出HP-PRRSV細(xì)胞培養(yǎng)物和LP-PRRSV疫苗毒。鄭鳴等[6]成功建立了PRRSV環(huán)介導(dǎo)間接PCR檢測方法，能有效鑒別HP/LP-PRRSV，可檢測出5.6 TCID50/mL LP-PRRSV和18 TCID50/mL HP-PRRSV的病毒RNA，HP/LP-PRRSV混合感染不影響檢測靈敏度，環(huán)介導(dǎo)間接PCR是一種簡便快速、靈敏、特異的病原學(xué)診斷工具，適合PRRSV感染的快速檢測，尤其適合HP/LP-PRRSV混合感染的鑒別。吳憶春[7]建立了PRRSV熒光定量PCR檢測方法，靈敏度達(dá)130拷貝/μL，與其他病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)，具有特異、敏感、快速、定量、重復(fù)性好等優(yōu)點，可用于臨床PRRS的診斷。張靖飛等[8]建立了一種快速檢測PRRSV并且能夠區(qū)分普通毒株和高致病性毒株的雙重?zé)晒釶CR方法，將該方法應(yīng)用于臨床標(biāo)本的檢測，通過對32份樣本的檢測，檢出陽性為28份，陽性率為87.5%，高致病性毒株為17份，陽性率為59.38%，表明建立的方法可以用于PRRSV的快速檢測，并且可以區(qū)分普通株和高致病性株。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測法

ELISA是一種生物活性物質(zhì)微量測定新技術(shù)，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)各領(lǐng)域，通過不斷改進(jìn)，形成了包括競爭ELISA、斑點ELISA、SPA-ELISA、雙抗體夾心ELISA、單抗體夾心LAB-ELISA以及血清學(xué)鑒別ELISA等，在檢測的靈敏度、特異性、操作簡便性以及實時性、高效性等方面都有很大提高。ELISA算是當(dāng)前應(yīng)用最廣、發(fā)展最快的一項微量測定技術(shù)[9]。孫晶等[10]建立了HP-PRRSV基因缺失標(biāo)記疫苗ELISA鑒別診斷方法，結(jié)果顯示批內(nèi)和批間重復(fù)試驗結(jié)果變異系數(shù)均低于10%，具有良好的重復(fù)性，對臨床血清檢測結(jié)果顯示，與IDEXX試劑盒檢測結(jié)果的符合率達(dá)94.84%，該方法為PRRSV基因工程標(biāo)記弱毒疫苗株在臨床鑒別診斷的應(yīng)用提高了有利保障。夏平安等[11]利用純化融合蛋白作包被抗原及優(yōu)化ELISA反應(yīng)條件，建立了可檢測抗PRRSV N蛋白抗體的間接ELISA方法(N-ELISA)，并利用所建立的N-ELISA與國外進(jìn)口的PRRS檢測試劑盒IDEXX-ELISA，對200份臨床送檢血清進(jìn)行平行檢測，陽性符合率為92.7%。結(jié)果表明，本試驗建立的N-ELISA的特異性接近IDEXX-ELISA。江云波等[12]以純化的融合蛋白為抗原，建立了豬繁殖與呼吸綜合征P5 6 ELISA檢測方法，與國外試劑盒IDEXX-ELISA總符合率為94.1%，表明建立的P5 6 ELISA檢測方法具有很好的特異性和敏感性。陳如敬等[13]建立的檢測PRRSV抗體的間接ELISA方法，對免疫豬繁殖與呼吸綜合征疫苗4周后的70份豬血清進(jìn)行檢測，其OD450nm值均大于0.85，表明其建立的重組GP5表位蛋白間接ELISA方法可用于臨床樣品的監(jiān)測。陳攀等[14]建立了PRRSV GP5蛋白的ELISA方法，用于評價豬群疫苗免疫或感染后抗體水平與免疫保護(hù)力之間的關(guān)系，結(jié)果表明特異性和重復(fù)性均較好，與豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬口蹄疫病毒血清抗體無交叉反應(yīng)。

2 中草藥添加劑的防治作用

2.1 直接抗病毒作用

直接抗病毒作用主要是指中藥添加劑通過阻斷病毒增殖過程中的吸附、傳入、復(fù)制和成熟中的某個環(huán)節(jié)而達(dá)到抗病毒的作用。冼瓊珍等[15]證實，板藍(lán)根、黃芩、青蒿對PRRSV有阻斷作用，穿心蓮、夏枯草、板藍(lán)根、黃芪、連翹、蘆根、青蒿有抑制病毒作用，青蒿、連翹、板藍(lán)根、黃芪、穿心蓮、黃芩有明顯的殺滅病毒作用；還證實了魚腥草、菊花、山銀花、知母、桂枝、麻黃、赤芍、柴胡、貫眾、梔子、薄荷葉、水牛角、地膽草共13種中藥有不同程度的抗PRRSV作用，綜合阻斷、抑制、殺滅3種作用方式，魚腥草、菊花、知母、桂枝、赤芍作用效果最好，麻黃、柴胡、貫眾效果次之[16]。胡梅等[17]研究表明，在安全濃度范圍內(nèi)，板藍(lán)根水提物體外對PRRSV具有顯著的直接殺滅作用，連翹、黃芪水提物和黃芪多糖體外對PRRSV均具有明顯的阻斷和抑制作用，為篩選抗PRRSV中藥制劑提供了理論依據(jù)。王學(xué)斌等[18]研究表明，板藍(lán)根能夠抑制PRRSV體外增殖，最小滅菌濃度和阻斷濃度分別0.195、0.097 mg/mL，而黃芪對PRRSV增殖的抑制作用較弱，板藍(lán)根和黃芪聯(lián)合使用時對PRRSV抑制作用顯著增強，該課題組還證實在安全濃度范圍內(nèi)，板藍(lán)根多糖體外對PRRSV具有較好的阻斷和抑制作用，最小阻斷和抑制濃度分別為2.094、8.375 μg/mL[19]。陳峰等[20]證實，金銀花提取物大孔樹脂600 mL/L的乙醇/水洗脫部位對PRRSV感染細(xì)胞具有較好的保護(hù)效果，最小保護(hù)濃度為6.25 μg/mL，可使PRRSV ORF7 mRNA含量降低1 000多倍。周洪銳等[21[22]研究表明，在安全濃度范圍內(nèi)，綠原酸對PRRSV具有顯著的體外抑制作用和阻斷作用，其對PRRSV的最小抑制濃度和阻斷濃度分別為0.391、0.0977 μg/mL。賀晶晶等[23]在確定青黛、花椒、衛(wèi)矛和沉香4種提取物的半數(shù)毒性濃度和最大無毒濃度基礎(chǔ)上，在濃度分別達(dá)到422.7、291.2、160.2、44.9 μg/mL時均能抑制PRRSV NP蛋白基因的表達(dá)，對PRRSV的增殖具有顯著的抑制效果，以衛(wèi)矛提取物的效果最佳。

2.2 間接抗病毒作用

中草藥添加劑和氨基酸可通過提高注射疫苗后的豬只抗體水平，從而發(fā)揮其抗PRRSV的作用。張紅英等[24]研究了板藍(lán)根多糖對PRRS滅活疫苗免疫T細(xì)胞亞群和抗體的影響，結(jié)果表明板藍(lán)根多糖能顯著提高仔豬的CD3+、CD8+淋巴細(xì)胞的比例和特異性抗體滴度，從而證實板藍(lán)根多糖能顯著增強豬對常規(guī)滅活病毒疫苗的免疫應(yīng)答能力。邵刪等[25]研究表明黃芪多糖和白花蛇舍草多糖均能顯著提高仔豬的CD3+、CD8+、CD4+淋巴細(xì)胞的百分比和特異性抗體滴度，即黃芪多糖和白花蛇舍草多糖均能顯著提高豬高致病性繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗的免疫水平，且白花蛇舍草多糖提高免疫的效力與劑量有關(guān)。吳瑗等[26]研究表明蘆薈多糖高低劑量在PRRSV滅活苗免疫的中后期差異顯著，高劑量蘆薈多糖組在免疫后第54天抗體水平比對照組抗體高出73.5%；對于活疫苗，高劑量蘆薈多糖能顯著提高抗體水平，而低劑量蘆薈多糖對抗體的產(chǎn)生無顯著作用。此外，王軍等[27]研究表明，飼糧中添加蘇氨酸和色氨酸可上調(diào)TLR3、TLR7、TLR8 mRNA的相對表達(dá)量，表明PRRS弱毒苗可能激活TLR3、TLR7、TLR8信號通路，進(jìn)而提高血清免疫球蛋白含量，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生，最終強化獲得性免疫。

3 小結(jié)

綜上所述，RT-PCR和ELISA兩種檢測方法能較好地檢測出PRRSV，具有重復(fù)性、特異性、可靠性強等優(yōu)點，在生產(chǎn)實踐中可以得到較好的推廣應(yīng)用；中草藥添加劑可通過阻斷病毒增殖過程中的吸附、傳入、復(fù)制和成熟中的某個環(huán)節(jié)而達(dá)到抗病毒的作用，也可以通過提高注射疫苗后的豬只體內(nèi)的抗體水平，從而發(fā)揮其抗PRRSV的作用，但是目前有關(guān)中草藥添加劑抗PRRSV的研究還局限于體外試驗，有待于進(jìn)一步在動物體內(nèi)水平對其作用效果進(jìn)行研究。

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S858.28

B

1673-4645(2014)12-0043-04

2014-08-19

劉笛秋，男，湖南益陽人，獸醫(yī)師，主要從事豬病防治工作