張素香

（山東省濟(jì)南市中醫(yī)醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250012）

病毒性疾病是嚴(yán)重危害人類身體健康的病種之一。疫苗的出現(xiàn)雖使某些疾病得到了控制，但至今仍有許多常見的病毒性感染缺乏滿意的制劑和預(yù)防措施。隨著對病毒預(yù)防的重視，中草藥以價格低廉、藥源廣泛而備受關(guān)注，成為病毒性疾病較為理想的防治藥物，最終達(dá)到既能殺滅病毒又對宿生細(xì)胞無影響的目的。中草藥抗病毒的機(jī)理主要是通過抑制或直接殺滅病毒，保護(hù)正常細(xì)胞和組織，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能來加強(qiáng)機(jī)體抗病毒能力。根據(jù)臨床實(shí)踐和現(xiàn)代中藥藥理學(xué)的研究，抗病毒中草藥可分為兩大類［1］：第一類是直接滅活或抑制病毒，常用的有黃芪、板藍(lán)根、麻黃、蒼術(shù)、五味子、蠶砂、桑葉、青蒿、馬鞭草、地丁、木賊、紫草、香附、夏枯草、天花粉、甘草、三七、大黃、大青葉、女貞葉、白頭翁、地榆、地骨皮、百部、防風(fēng)、連翹、吳茱萸、牛黃、虎杖、側(cè)柏葉、金銀花、魚腥草、茵陳、厚樸、穿心蓮、桂枝、柴胡、菊花、野菊花、黃連、黃柏、蛇床子、蒲公英、薄荷、芍藥、艾葉、蜂膠和射干等；第二類是通過誘生干擾素或促進(jìn)人體免疫功能而達(dá)到抗病毒作用，常用的有人參、茯、豬苓、黨參、山藥、首烏、巴戟天、靈芝、黃精、肉蓯蓉、兔絲子、山茱萸、當(dāng)歸、刺五加、枸杞子、蟲草等。

流行性感冒（簡稱流感）疫苗和抗病毒藥物在應(yīng)用于臨床或人體之前，必須要進(jìn)行充分的實(shí)驗(yàn)室檢測。動物體內(nèi)試驗(yàn)比體外試驗(yàn)更接近人體環(huán)境，更能了解流感病毒的致病機(jī)理和人類相應(yīng)的病理損傷與免疫反應(yīng)，因此動物體內(nèi)試驗(yàn)研究意義更大。要做好體內(nèi)試驗(yàn)，首要任務(wù)是要構(gòu)建合理可靠的動物模型。

1 建立模型的原則［2］

相似性：模型與人類有相似的發(fā)病機(jī)理和癥狀，才利于將復(fù)制的動物模型試驗(yàn)結(jié)果外推及人。

重復(fù)性：理想的動物模型應(yīng)是規(guī)范的，可以準(zhǔn)確重復(fù)再現(xiàn)的。毒株的型別、接種的數(shù)量、接種途徑、疾病發(fā)展時期、周圍的環(huán)境和接種動物所處的免疫狀態(tài)都將影響所建的疾病類型。所以試驗(yàn)時，除試驗(yàn)因素外，應(yīng)盡量保證試驗(yàn)組和對照組其他條件一致［3］。

可靠性：復(fù)制動物模型力求可靠地反映人類疾病，應(yīng)具備該種疾病的特征。

適用性和可控性：在制備動物模型時，應(yīng)盡量考慮到臨床應(yīng)用，便于控制疾病的發(fā)展，便于進(jìn)一步進(jìn)行人體內(nèi)研究。

2 動物模型的鑒定

模型是否建造成功，一般有4種鑒定方法。

一般活動：如是否活動減慢，飲食減少，蜷縮，卷毛，體重減輕，體溫變化。

分離病毒：流感病毒感染動物后，在感染的高峰期分離組織或血清，可通過雞胚接種，細(xì)胞培養(yǎng)，或是直接通過血凝試驗(yàn)或是血凝抑制試驗(yàn)鑒別流感病毒。

免疫學(xué)鑒別：通過相應(yīng)免疫學(xué)試驗(yàn)如抗原抗體的特異性反應(yīng)鑒別流感病毒，通過檢測細(xì)胞因子如炎性因子（IL－1、IL－6、IL－18和 TNF－ α）、干擾素（IFN － α）的變化。

基因方法：通過逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）法，可以直接檢測動物呼吸道或肺部組織中的IFV基因片段，或通過基因測序檢驗(yàn)和流感病毒基因的吻合度。用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)［4］，直接檢測流感病毒復(fù)制量的情況，簡便快捷，靈敏特異，但費(fèi)用較高。

3 動物模型的選擇

3.1 小鼠模型

小鼠被廣泛應(yīng)用于檢測抗病毒藥物和疫苗的有效性。小鼠的品系和品種很多，經(jīng)常用于流感病毒建模的有BALB／C鼠、昆明鼠、ICR鼠和NIK鼠，對于哪一種小鼠對流感病毒更敏感，尚無相關(guān)研究和結(jié)論。

在正式開始試驗(yàn)前要將病毒在鼠肺內(nèi)傳代，制備鼠肺適應(yīng)株。通過連續(xù)傳代，使突變體對小鼠產(chǎn)生更高的病毒滴度和更強(qiáng)的致病性。但是，高致病性H5N1無需經(jīng)小鼠體內(nèi)適應(yīng)就能引起嚴(yán)重的疾病［5］。所有細(xì)支氣管、肺泡上皮細(xì)胞都對其易感［6］，能引起嚴(yán)重病變甚至死亡［7］。流感病毒可通過滴鼻或暴露于有小顆粒氣溶膠的環(huán)境感染小鼠。是否需要麻醉對確定治療效果非常重要。滴鼻接種較大量病毒后，小鼠將發(fā)生下呼吸道感染，如肺實(shí)變和間質(zhì)性肺炎［8］，暴露于強(qiáng)毒株后，小鼠2～4 d后出現(xiàn)一般活動減慢，飲食減少，體重不增加或減少，蜷縮，抱團(tuán)，然后離開鼠群，呼吸頻率加快，毛不光滑，體溫下降。較強(qiáng)毒株導(dǎo)致的死亡發(fā)生于染毒后的 5 ～ 12 d［9］。

小鼠作為流感病毒模型有其顯著優(yōu)勢，如對流感病毒較敏感、生理生化與人類相似，價格便宜，飼養(yǎng)簡單，安全性高，相關(guān)的物質(zhì)提取和檢測已商品化，研究較多，有經(jīng)驗(yàn)可尋。

小鼠作為流感病毒的動物模型的主要缺陷是與人的癥狀不同。例如大多數(shù)鼠發(fā)病后體溫降低，而不是升高［10］。除此以外，小鼠幾乎沒有鼻腔分泌物［11］，也沒有和人類相似的上呼吸道感染癥狀［10］。流感病毒各類型間對小鼠的免疫反應(yīng)都有效。例如，小鼠感染了非致死量的A／PR8／34H1N1，幾周或幾月之后接種H3N2，IgA抗體將在小鼠體內(nèi)進(jìn)行亞型間免疫［12］。而盡管已經(jīng)觀察到了人類的特異性免疫，但對于病毒間的異型保護(hù)尚未發(fā)現(xiàn)。

3.2 雪貂模型

最初雪貂被選為流感模型是1933年瑞士的Andrews和Laidlaw所做的試驗(yàn)［13］，隨后雪貂模型迅速成為人類甲流的臨床模型［14－15］。流感病毒可引起呼吸道的急性癥狀，像流鼻涕、打噴嚏、咳嗽、體重減輕、體溫升高、上呼吸道免疫細(xì)胞明顯增加，急性癥狀將持續(xù)3～4 d，在血清中可檢測到HI抗體［16］。弱毒株幾乎不會引起死亡，如感染 A ／Aichi／2／68 （H3N2）僅僅是陣發(fā)性打噴嚏和少量較清鼻腔分泌物［17］。病毒經(jīng)雪貂體內(nèi)不斷傳代，可引起更明顯、更嚴(yán)重的肺炎，可影響到氣管、細(xì)支氣管和肺泡。在雪貂群中，流感病毒感染性很強(qiáng)，甚至可傳播給接觸它們的工作人員。

雪貂對來源于自然界、雞胚接種或細(xì)胞培養(yǎng)的甲型或乙型流感病毒，都具有高度敏感性，不需進(jìn)行體內(nèi)傳代［3］。已證實(shí)，NA突變和藥物抗藥性的改變很少在雪貂之間或代間傳播［18］。所以即使有抗藥性的改變，動物模型仍然可以繼續(xù)使用。而且流感癥狀也和人相似，主要為明顯的上呼吸道癥狀。然而，由于此模型所對應(yīng)的相關(guān)試驗(yàn)缺乏或是不完整，限制了雪貂流感模型的發(fā)展。而且由于流感病毒可由雪貂傳播給人，所以試驗(yàn)時要更加注意安全問題。

3.3 大鼠模型

在 1 次試驗(yàn)中，流感病毒 A ／Port／Chalmers／173 （H3N2）感染了 Brown Norway （BN），F(xiàn)ischer－344 （F344）and Sprague－Dawley （SD）大鼠［19］。經(jīng)肺內(nèi)傳代 11 次后，F(xiàn)344 和 SD 大鼠試驗(yàn)組病毒滴度比對照組提高了100倍。但這種感染非致死性的，很少能引起肺部明顯病變。大鼠作為評價流感病毒治療方面的模型并未表現(xiàn)出足夠的優(yōu)勢。

3.4 豬模型

因甲型流感病毒經(jīng)常在豬群之間傳播，所以豬也成為流感模型的一個選擇。感染流感病毒后的癥狀為發(fā)燒、食欲減退、呼吸困難、咳嗽，一般不會致死［3］。豬對最近流行的 H5N1 敏感性較低［20］。迄今為止，豬主要用于抗豬流感疫苗的發(fā)展［21］。因豬存在圈養(yǎng)，養(yǎng)殖復(fù)雜且廢物處理等棘手問題，而且豬肉被人大量食用，所以豬模型很少用于試驗(yàn)研究［3］。因此，即將面世的迷你豬，可能會對流感病毒的研究提供很大幫助。

3.5 非人類靈長類

比起其他動物，靈長類動物更接近人類。恒河猴已經(jīng)被用于研究流感發(fā)病機(jī)理、評估治療和預(yù)防策略［22］。Rimmelzwaan等用流感病毒A／Netherlands／18／94感染獼猴，并分析了直接氣管感染后的免疫反應(yīng)。豚尾猴已于2004年被Baskin等［23］用于流感病毒轉(zhuǎn)錄因子的研究。但由于各方反對，靈長類很難大量用于建造試驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

3.6 其他

還有其他動物曾用于流感病毒動物模型。如豚鼠和棉鼠就曾分別用于研究流感傳播和免疫反應(yīng)的數(shù)量和質(zhì)量［24－25］。

4 結(jié)語

中草藥可成為較理想的抗流感病毒藥物。目前，在進(jìn)行動物流感試驗(yàn)時，小鼠流感模型具有諸多優(yōu)點(diǎn)，是流感病毒模型的主要類型；將來，等相關(guān)試劑更完善后，雪貂有可能會取代小鼠模型的地位；迷你豬的問世，也為流感病毒模型提供了一個好的選擇；隨著科學(xué)的不斷發(fā)展，也會發(fā)現(xiàn)更多更合適的流感動物模型。

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