（蘭州市西固區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，甘肅蘭州 730000）

弓形蟲致密顆粒蛋白6（GRA6）的研究進展

王學(xué)儉

（蘭州市西固區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，甘肅蘭州 730000）

致密顆粒是由弓形蟲致密顆粒細胞器分泌的一類具有免疫活性的蛋白質(zhì)，它們在弓形蟲的入侵，蟲體在宿主細胞內(nèi)的存活和繁殖方面起著重要作用。本文就致密顆粒蛋白6的分子結(jié)構(gòu)、在蟲體入侵中的作用、蟲體基因分型以及在弓形蟲病診斷和疫苗研制等方面的研究進展作一簡要綜述。

弓形蟲；致密顆粒蛋白6；入侵；診斷；疫苗研制

弓形蟲（Toxoplasma gondii）是一種重要的機會性致病原蟲，可寄生在多種哺乳動物（包括人）的有核細胞中，由其引發(fā)的弓形蟲病在全世界范圍內(nèi)廣泛流行，給人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展造成了巨大的損失。致密顆粒蛋白（dense granule protein，GRA）是弓形蟲體內(nèi)重要的代謝分泌抗原，已知的致密顆粒蛋白有10種，在弓形蟲病的診斷及免疫預(yù)防中存在潛在價值。而致密顆粒蛋白6由于其存在于速殖子和緩殖子中，與蟲體在細胞內(nèi)寄生、發(fā)育密切相關(guān)，近年來逐漸被人們所關(guān)注[1]，現(xiàn)將它的國內(nèi)外研究進展?fàn)顩r綜述如下：

1 GRA6的分子結(jié)構(gòu)特征

GRA6無內(nèi)含子，單拷貝，基因序列長為1632 bp，開放閱讀框為735 bp，有兩個起始密碼子均可以作為起始密碼，但第一個密碼子更適合作為翻譯的起始點。編碼230個氨基酸，中部疏水區(qū)側(cè)翼有兩個親水區(qū)，含有4組與GRA5蛋白同源的氨基酸。C-末端親水區(qū)含24%的甘氨酸和29%的酸性殘基，但N末端結(jié)構(gòu)域并不符合信號肽特征。有一個潛在的N-糖基化點位于殘基74位，含2個疏水區(qū)域，其中一個疏水區(qū)域位于偏向N端，另一個疏水區(qū)域位于中央處，具有跨膜結(jié)構(gòu)域[2-3]。Lecordier等[4]把全部GRA6的開放閱讀框序列導(dǎo)入表達載體pGEX，得到低表達量的不溶性融合蛋白，并又設(shè)計不同的引物，分別從弓形蟲GRA6基因上擴增基因片段，導(dǎo)入表達載體pGEX，然后在大腸桿菌中進行表達、得到位于N端親水區(qū)域蛋白抗原和位于C端親水區(qū)域蛋白抗原，而只有編碼N端重組抗原能被弓形蟲感染人的血清所識別，表明GRA6 N端多肽含有被B淋巴細胞識別的抗原表位。GRA6與GRA5之間存在一定氨基酸序列上的同源性，因此有血清學(xué)上的交叉反應(yīng)。

2 GRA6在弓形蟲入侵中的作用

在弓形蟲侵染脊椎動物細胞的實驗中連續(xù)觀察到微線體、棒狀體和致密顆粒蛋白的出現(xiàn)[5-6]。弓形蟲附著于宿主細胞引起頂端釋放微線體蛋白MIC2，接著宿主細胞的胞漿膜內(nèi)褶，釋放棒狀體蛋白ROP1，形成納蟲泡。致密顆粒是頂復(fù)門所特有的分泌細胞器，在入侵后不久，致密顆粒蛋白被大量的分泌入納蟲泡中。盡管存在很多疏水區(qū)域，它們?nèi)匀灰钥扇艿途畚锏男问竭M入納蟲泡，并且穩(wěn)定的與納蟲泡膜相連。GRA4和GRA6在致密顆粒中初級包裝為可溶性蛋白質(zhì)，接著釋放入納蟲泡。而GRA6主要由疏水作用來進行的，該蛋白質(zhì)以磷酸化形式出現(xiàn)提示其同膜網(wǎng)絡(luò)間關(guān)聯(lián)的增加。GRA4、GRA6和GRA2相互作用，形成一個多聚體復(fù)合物，便于同泡內(nèi)網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定地關(guān)聯(lián)，該蛋白質(zhì)多聚體的形成，依賴于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用和疏水作用，它還可能參與納蟲泡內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)或蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運[9]。

Braun L等[7]用帶有HA-FLAG標(biāo)簽的GRA2和GRA5蛋白與敲除GRA2和GRA5基因的弓形蟲作用，再用親和層析純化，結(jié)果顯示在弓形蟲和納蟲泡的可溶部分內(nèi)，GRA2-HA-FLAG 和GRA5-HA-FLAG和GRA6、GRA3相結(jié)合。這說明在致密顆粒中，GRA6、GRA2、GRA3、GRA5等結(jié)合在一起，通過將疏水區(qū)域包埋在內(nèi)部而形成一個高分子量的可溶球狀復(fù)合物。Mercier等[8-9]發(fā)現(xiàn)弓形蟲侵入宿主細胞后，GRA6移至納蟲泡的后部，同GRA2一樣，定位于一簇多層小囊泡，GRA2起著誘導(dǎo)納蟲泡表面網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成的作用，GRA6的作用是穩(wěn)定網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；隨后Mercier等采用基因敲除技術(shù)，分別敲除了弓形蟲的GRA2和GRA6基因，發(fā)現(xiàn)GRA2敲除株侵入宿主細胞后其納蟲泡不能正確形成，管狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被一些小的凝集物取代，而且GRA6也不能正確的定位于管狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)上，GRA6敲除株雖然能夠形成成熟的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，但由于缺乏GRA6，排列有序的管狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被小的囊泡所取代。

3 GRA6在弓形蟲基因分型方面的研究

在弓形蟲的分子遺傳學(xué)研究中，PCR-RFLP被廣泛應(yīng)用于蟲株基因型的研究。Fazaeli等[10]用核酸分析軟件比較，已報道9株不同弓形蟲地理株（TONT、CASTELLS、RUB、MAS、M7741、NED、ME49、BEVERLEY和RH）的GRA6基因序列，發(fā)現(xiàn)在N端區(qū)域基因較為保守，而C端區(qū)域有一定的差異；采用序列多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)不同弓形蟲株的GRA6基因存在著變異，通過序列比對，觀察到在GRA6基因690 bp的序列中有24個核苷酸位點有多態(tài)性，弱毒株還有6個氨基酸的缺失，所有位點多態(tài)性均可導(dǎo)致氨基酸序列的改變，氨基酸序列的變化導(dǎo)致弓形蟲不同蟲株的抗原性和毒力發(fā)生差異。Howe等[11]對來自人和動物的106株弓形蟲株DNA的6個酶切位點進行PCR-RFLP分析，根據(jù)基因序列相似性將106個蟲株分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個基因型，極少數(shù)蟲株屬于混合型?；蛐廷竦墓蜗x是強毒株，在小鼠模型中致病性很強，產(chǎn)生高度蟲血癥；基因型Ⅱ與慢性感染之間具有密切關(guān)系，并使小鼠模型產(chǎn)生高負荷的包囊，人類弓形蟲病主要與基因型Ⅱ的弓形蟲株有關(guān)；基因型Ⅲ的弓形蟲在動物體內(nèi)出現(xiàn)的頻率高于人。Fazaeli等[10]用MseⅠ酶對30株弓形蟲的GRA6基因進行PCR-RFLP分析，結(jié)果顯示GRA6基因可作為分子標(biāo)記用于PCRRFLP分析，以區(qū)分弓形蟲種株間的基因型。

Zia-Ali等[12]在伊朗Tehran和Mazandaran地區(qū)，以GRA6作為分型基因，對該地區(qū)中血清學(xué)檢測為陽性的24只綿羊，5只山羊，23只野雞，5只鴨，2只野貓，分離出弓形蟲后進行基因分型，結(jié)果只發(fā)現(xiàn)基因II型和III型，未發(fā)現(xiàn)基因1型或者混合感染的情況。Peyron等為了研究弓形蟲的種類，地域分布以及弓形蟲病的臨床癥狀等方面的內(nèi)容，以GRA5 和GRA6為抗原用間接ELISA檢測方法對來自歐洲不同國家及哥倫比亞252份慢性感染弓形蟲的孕婦的血清進行分型，結(jié)果顯示歐洲為II型弓形蟲感染，哥倫比亞則為I和III型。謝德華等[13]首次對國內(nèi)來自不同宿主的4個弓形蟲蟲株以及國際標(biāo)準(zhǔn)強毒株RH 株的GRA6 基因進行PCR-RFLP 分析，發(fā)現(xiàn)RH株、SH株、CN 3 株弓形蟲的GRA6基因序列的MseΙ酶切位點與國外報道的RH 株一致，同屬于基因型Ι為強毒株；QH株 和ZS 2株弓形蟲的MseΙ酶切位點與國外報道的弱毒株BEVERLEY 株和ME49 株一致，同屬于基因型Ⅱ。除MseΙ酶切位點外，中國的幾個蟲株GRA6 序列與GenBank中注冊的RH株及BEVERLEY 和ME49 兩株弱毒株有個別堿基的差異，這些差異可能是由于蟲株的地域差異造成的。

4 GRA6在弓形蟲病診斷和疫苗研制方面的研究

常用的弓形蟲診斷試劑盒以速殖子作為診斷抗原，而速殖子一般經(jīng)鼠腹水或組織培養(yǎng)中進行繁殖而獲得，故帶有各種不同的蟲體外物質(zhì)。由于缺少純化的標(biāo)準(zhǔn)抗原或標(biāo)準(zhǔn)的純化抗原的方法，各種實驗結(jié)果也有所不同[14]。目前對弓形蟲診斷的進展主要是通過抗原基因克隆與表達手段，用純化的重組蛋白作為診斷抗原，檢測感染者血清抗體。GRA6分子存在于弓形蟲的致密顆粒及納蟲泡中并能分泌出來，當(dāng)速殖子分裂并侵入細胞時，它便可作為抗原刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，因而抗GRA6抗體可以作為早期活動性感染的指標(biāo)。

Lecordie等分別從弓形蟲GRA6基因偏N端和偏C端區(qū)域擴增基因片段，導(dǎo)入表達質(zhì)粒pGEX，然后在大腸埃希菌中進行表達，得到位于偏N端親水區(qū)域蛋白和位于偏C端親水區(qū)域蛋白，而只有編碼偏N端重組抗原能被弓形蟲感染者血清所識別，用GRA6偏N端親水蛋白多肽構(gòu)建重組蛋白檢測弓形蟲感染者血清IgG 的敏感性達96%。李越希等[15]分別選擇弓形蟲GRA6 蛋白和P30 蛋白內(nèi)的抗原性強、特異性好的部分片段，利用基因工程技術(shù)表達兩者的融合蛋白，用該融合蛋白作為抗原，間接ELISA試驗檢測已知6份抗弓形蟲陰性血清和6份抗弓形蟲陽性血清。結(jié)果顯示，6份抗弓形蟲IgM 陰性血清均不顯色，6份抗弓形蟲IgM陽性血清均出現(xiàn)顯色反應(yīng)，說明該融合蛋白有較好的抗原性和特異性。另外檢測了實驗室保存的184份正常人血清，它們的A450值均小于0.05，進一步證實了該融合蛋白有較好的特異性。Fatoohi等用融合蛋白的方法，分別將GRA1 和GRA6 與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）連接表達在大腸桿菌，ELISA 方法分別檢測GST-GRA1 及GST-GRA6 被病人血清的識別率，發(fā)現(xiàn)GST-GRA1與GST-GRA6 可相互補充，使敏感性達到98 %。

Hofgartner等[16]為了準(zhǔn)確診斷孕婦弓形蟲病的感染情況，用GRA6的重組蛋白分別進行IgG和IgM間接ELISA試驗，被檢孕婦按發(fā)病癥狀分為三組：急性癥狀（I組），慢性癥狀（II組）和無癥狀（III組）。為了區(qū)分I組和II組，用GRA6-IgG-ELISA檢測其敏感性分別為87.5% 和 94.1%，而用GRA6-IgM-ELISA檢測，則敏感性分別為91.7%和2.9%，說明用GRA6的重組蛋白分別進行IgG和IgM間接ELISA試驗，可以從血清學(xué)上區(qū)分孕婦弓形蟲病的急性感染和慢性感染。Gatkowska等用六種弓形蟲重組抗原GRA6，GRA1，GRA7，p35，SAG1，SAG2來檢測小鼠感染弓形蟲的情況。由小鼠感染不同蟲株所制備的血清進行ELISA檢測，急性感染的血清與GRA6，GRA7，p35有很高的反應(yīng)性；而慢性感染的血清則與SAG1，SAG2反應(yīng)強烈。這說明用不同的重組抗原可以在臨床上鑒定弓形蟲病的急性感染和慢性感染，GRA6作為一個理想的重組診斷抗原可以檢測弓形蟲病急性感染的情況。Redlich等用重組的GRA6-GST融合蛋白作為檢測抗原，檢測了431份來自急、慢性弓形蟲感染病人的血清樣本，其中對急性弓形蟲病檢測的特異性達到99.6%，對隨機抽取的159份血清樣本進行檢測，陽性率僅為4.0%。

朱翔等[17]分別從弓形蟲昆山分離株和RH株總DNA中擴增到編碼GRA6偏N端的基因片段，經(jīng)分析基因序列基本一致，故其重組蛋白可用于對不同地理株弓形蟲感染的診斷；再將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEX-GRA6轉(zhuǎn)化大腸埃希菌中表達，免疫印跡分析證實該重組蛋白能被抗弓形蟲血清特異IgM和IgG抗體識別，而純化的GST蛋白未能被血清識別，其結(jié)果與Makioka等[20]報道的一致，顯示了GST-GRA6重組蛋白的良好免疫反應(yīng)性，可以被急性和慢性期弓形蟲感染者血清中IgM和IgG抗體所識別。

GRA存在于弓形蟲速殖子階段和緩殖子階段，可作為急性感染和慢性感染的診斷抗原及可能的疫苗成分。盡管有一些報道了弓形蟲其他蛋白抗體的保護效果，但是關(guān)于GRA6抗體的保護作用報道的很少。因此Cha等進行了一系列試驗用來評估致密顆粒蛋白（GRA2，GRA6）和表膜蛋白1（SAG1）的單克隆抗體在弓形蟲速殖子入侵上的抑制效果；用以上單克隆抗體被動免疫小鼠，然后再用致死劑量的速殖子攻擊小鼠，其存活時間明顯延長；用GRA6和SAG1的單克隆抗體預(yù)先處理的速殖子攻擊小鼠，其存活時間也明顯延長；而用兩種單克隆抗體同時處理過的速殖子攻擊小鼠其存活時間則比任何一種都要長。用GRA6單克隆抗體處理過的成纖維細胞和巨噬細胞對速殖子的入侵起到很強的抑制作用。以上試驗說明GRA6的抗體對控制弓形蟲感染起到一定作用。

5 展望

GRA6序列的多態(tài)性，特別是其序列上含有的MseΙ酶切位點，通過PCR-RFLP技術(shù)，已經(jīng)成為國內(nèi)外學(xué)者進行弓形蟲蟲株分類的首選基因之一；利用GRA6在納蟲泡中特殊的作用機理，GRA6蛋白自身良好的反應(yīng)性，GRA6蛋白在臨床檢測弓形蟲病感染以及感染的病程上，也已被愈來愈多地應(yīng)用。然而，GRA6蛋白作為保護性抗原方面的研究卻很少，在國內(nèi)尚未有這方面的報道。是否將其研制為集基因分型、診斷、免疫為一體的多功能基因還有待于進一步研究。如果可行，這將為弓形蟲病的綜合預(yù)防，診斷試劑的研制起到很大的促進作用。

[1] Ferguson D J，Cesbron–Delauw M F，Dubremetz J F，et al.The expression and distribution of dense granule proteins in the enteric（coccidian）forms of Toxoplasma gondii in the small intestine of the cat experimental[J]. Parasitology，1999，91（3）：203-211.

[2] Labruyere E，Lingnau M，Mercier C，et al. Differential membran targeting of the secretory proteins GRA4 and GRA6 within the parasitophorous vacuole formed by Toxoplasma gondii[J]. Mol Biochem Parasitol，1999，102（2）：311-324.

[3] Fazaeli A，Carter P E，Darde M L，et al. Molecular typing of Toxoplasma gondii strains by GRA6 gene sequence analysis[J]. Int J Parasitol，2000，30（5）：637-642.

[4] Lecordier L，Moleon-Borodowsky I，Dubremetz J F，et al. Characterization of a dense granule antigen of Toxoplasma gondii（GRA6）associated to the network of the parasitophorous vacuole[J]. Mol Biochem Parasitol，1995，70（1/2）：85-94.

[5] Carruthers V B，Sibley L D. Sequential protein secretion from three distinct organelles of Toxoplasma gondii accompanies invasion of human fi broblasts[J]. Eur J Cell Biol，1997，73（2）：114-123.

[6] Sibley L D，Niesman I R，Parmley S F，et al. Regulated secretion of multi-lamellar vesicles leads to formation of a tubulovesicular net work in host cell vacuoles occupied by Toxoplasma gondii[J]. J Cell Sci，1995，108（4）：1669-1677.

[7] Braun L，Travier L，Kieffer S，et al.Purif i cation of Toxoplasma dense granule proteins reveals that they are in complexes throughout the secretory pathway[J]. Mol Biochem Parasitol，2008，157（1）：13-21.

[8] Mercier C，Lecordier L，Darcy F，et al. Molecular characterization of a dense granule antigen（GRA2）associated with the network of the parasitophorous vacuole in Toxoplasma gondii [J]. Mol Biochem Parasitol，1993，58（1）：71-82.

[9] Mercier C，Dubremetz J F，Rauscher B，et al. Biogenesis of nanotubular network in Toxoplasma parasitophorous vacuole induced by parasite proteins[J]. Mol Biol Cell，2002，13（7）：2397-2409.

[10] Fazaeli A，Carter P E，Darde M L，et al. Molecular typing of Toxoplasma gondii strains by GRA6 gene sequence analysis[J]. Int J Parasitol，2000，30（5）：637-642.

[11] Howe D K，Sibley L D. Toxoplasma gondii comprises three clonal lineages：correlation of parasite genotype with human disease[J]. Journal of Infectious Disease，1995，172（6）：1561-1566.

[12] Zia-Ali N，F(xiàn)azaeli A，Khoramizadeh M，et al .Isolation and molecular characterization of Toxoplasma gondii strains from different hosts in Iran[J]. Parasitol Res，2007，101（1）：111-115.

[13] 謝德華，翁亞彪，李華文，等. 中國4 個弓形蟲蟲株GRA6基因的比較分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38（7）：1495-1500.

[14] 辛?xí)苑?，秦進才，薄淑英. 國內(nèi)外十種弓形蟲抗體診斷試劑盒的質(zhì)量比較[J]. 中國人獸共患病雜志，2001（ 17）：117-118.

[15] 李越希，張錦海，陶開華，等. 弓形蟲GRA6 蛋白和P30 蛋白的融合表達、純化及抗原性分析[J]. 生物工程學(xué)報，2003，19（6）：674-679.

[16] Hofgartner W T，Swanzy S R，f3acina R M，et al. Detection of immunoglobulin（IgG）and（IgM）antibodies to Toxoplasma gondii：evaluation of four commercial immunoassay systems[J]. Microbiol，1997，35（12）：3313-3315.

[17] 朱翔，丁天，陸惠民，等. 弓形蟲GRA6抗原基因的克隆與表達[J]. 中國人獸共患病雜志，2003，19（2）：50-54.

Research progress on dense granule protein 6 of Toxoplasma gondii

Wang Xuejian
（Xigu Center for Animal Disease Control and Provention，Gansu，Lanzhou 730000）

Dense granules are a series of immunologically competent proteins secreted by dense granule organelle of Toxoplasma gondii，and play important roles in the invasion，survival and propagation of Toxoplasma gondii. This paper reviews the progress in research of dense granule protein 6 including molecular structure，the function to invade，genotyping，diagnosis and vaccine development for toxoplasmosis.

Toxoplasma gondii；Dense granule protein 6；Invadsion；Diagnosis；Vaccine development

S 852.723

：A

：1005-944X（2014）02-0045-04

國家自然科學(xué)基金項目（31001061）。