唐澤波 溫 娜 張 宇 劉興吉 金 宏 齊 玲 于洪泉

(吉林醫(yī)藥學(xué)院后勤管理處，吉林 吉林 132013)

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，惡性程度高，約占顱內(nèi)腫瘤的45%〔1〕。如何有效控制甚至治愈膠質(zhì)瘤仍是亟待解決的難題。五味子多糖(CPSC)是從五味子成熟干燥果實中提取的含有五味子總多糖、17種以上氨基酸和16種以上微量元素的混合物，具有抗腫瘤活性〔2～8〕，但其具體的抗腫瘤作用機制尚不清楚。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)CPSC可以抑制膠質(zhì)瘤細胞的生長〔9〕。本文進一步研究CPSC對體外培養(yǎng)裸鼠膠質(zhì)瘤細胞誘導(dǎo)其凋亡的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1細胞和主要試劑 裸鼠膠質(zhì)瘤細胞本實驗室提取；五味子多糖(北華大學(xué)提供)；細胞培養(yǎng)基RPMI-1640(Thermo公司)，小牛血清和0.25%胰蛋白酶(美國Gibco公司)，半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3抗體(北京中杉公司)。

1.2提取原代裸鼠膠質(zhì)瘤細胞 留取新鮮的裸鼠腦膠質(zhì)瘤組織，用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后將組織剪成碎塊，置于10 ml離心管中，并加入木瓜蛋白酶放于37℃培養(yǎng)箱中消化30 min，吸取上清液，加血清終止消化，以300 r/min離心5 min后棄上清，加培養(yǎng)液反復(fù)吹打，過濾后以300 r/min速度離心5 min，離心棄上清，加入含10%血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，臺盼藍計數(shù)活細胞，以2×106/75 cm2密度將細胞接種于培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)12 h待用。

1.3ELISA法測定裸鼠膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)上清中Caspase-3蛋白表達 將裸鼠腦腫瘤細胞以1×106/ml密度接種于24孔培養(yǎng)板中，實驗分為對照組(不含藥物)和CPSC組(0、200、400、800 μg/ml)，作用48 h，每組設(shè)5個復(fù)孔。取細胞培養(yǎng)上清，將上清液與包被液按1∶1比例包被后4℃過液。封閉后加入Caspase-3抗體(1∶500稀釋)于4℃過夜。加入二抗(1∶1 000稀釋)室溫下孵育2 h，加顯色液室溫避光顯色。于自動酶標(biāo)儀492 nm處測定A值。

1.4細胞免疫組織化學(xué)法檢測Caspase-3蛋白在裸鼠膠質(zhì)瘤細胞的陽性表達率 按上述方法和分組用不同劑量CPSC作用細胞48 h后，吸出培養(yǎng)上清，取出玻片，10%甲醛溶液固定30 min，空氣干燥；滅活內(nèi)源性過氧化物酶；一抗過夜，二抗室溫孵育2 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。鏡下觀察，以細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性著色，按照公式計算Caspase-3蛋白表達陽性率。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1CPSC對體外培養(yǎng)裸鼠膠質(zhì)瘤細胞上清中Caspase-3蛋白表達水平 不同濃度(0、200、400、800 μg/ml)CPSC作用裸鼠膠質(zhì)瘤細胞48 h后，其培養(yǎng)上清中Caspase-3蛋白表達水平均升高(0.79±0.02、0.86±0.01、0.91±0.01)，與對照組(0.71±0.01)比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.2細胞免疫組織化學(xué)法檢測各組裸鼠膠質(zhì)瘤細胞Caspase-3陽性表達率 CPSC作用裸鼠膠質(zhì)瘤細胞48 h后，與對照組(26.42%±6.06%)比較，200、400和800 μg/ml多糖組Caspase-3表達陽性率(44.78%±6.58%、58.98%±3.32%、73.33%±5.12%)均明顯升高(P<0.01)。

3 討 論

腦膠質(zhì)瘤目前治療方案仍然是手術(shù)切除輔以放療和化療等綜合治療為主。誘導(dǎo)或促進腫瘤細胞凋亡是冶療腫瘤的基本方法之一。

細胞凋亡是級聯(lián)式基因表達的結(jié)果，可以通過多種形式誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。在細胞凋亡的機制研究中提出了兩條主要信號途徑，線粒體途徑和死亡受體途徑〔9〕。Caspases是凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路，許多調(diào)控細胞凋亡的因素都通過Caspases酶系起作用，其中Caspases-3是該家族中最關(guān)鍵的效應(yīng)分子，負(fù)責(zé)對凋亡途徑最后執(zhí)行階段的全部或部分關(guān)鍵性蛋白的酶切，被稱為凋亡的執(zhí)行者〔6〕。當(dāng)細胞接受凋亡信息時，經(jīng)過一系列反應(yīng)激活Caspases-3，活化的Caspases-3通過激活、破壞某些酶，或破壞細胞骨架蛋白等方式，最終導(dǎo)致特征性DNA斷裂，從而介導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡。CPSC是否能通過激活Caspases-3而實現(xiàn)抗膠質(zhì)瘤作用目前報道不多。本研究結(jié)果說明CPSC可能是通過上調(diào)Caspase-3蛋白激活了線粒體信號傳導(dǎo)路徑，引起細胞凋亡，從而使裸鼠膠質(zhì)瘤細胞發(fā)生凋亡。

4 參考文獻

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8Movsesyan VA,Stoica BA,Yakovlev AG,etal.Anandamide induced cell death in primary neuronal cultures role of calpain and caspase pathways[J].Cell Death Differ,2004；11(10):1121-32.

9溫 娜，唐澤波，袁 瑞，等.五味子粗多糖對腦膠質(zhì)瘤細胞生長的作用〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2013；32(12)：2837-8.