響應(yīng)面法優(yōu)化載兒茶素葉酸偶聯(lián)殼聚糖納米粒的制備工藝

劉步云，王永麗，于奇建，劉 芳，臧金紅，金鈴和，李大鵬，李 鋒,*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

兒茶素屬黃烷醇類化合物，是茶葉中主要的活性成分之一，約占茶多酚總量的60%～80%。研究表明兒茶素具有很強(qiáng)的抗氧化活性[1]，以及防癌抗癌、抗突變、廣譜抑菌、免疫調(diào)節(jié)和保護(hù)心血管等多種功效[2-3]，因此，在食品、醫(yī)藥和精細(xì)化工等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。但是，兒茶素在生理水相環(huán)境中極不穩(wěn)定，易聚合或異構(gòu)化；其含有的多個(gè)酚羥基與水分子之間也易形成氫鍵，從而導(dǎo)致兒茶素脂溶性差，大大降低了其在體內(nèi)的吸收和利用率[4]。而且，兒茶素進(jìn)入人體后半衰期很短，90%以上的兒茶素在體內(nèi)發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化或由糞便或尿液排出，顯著降低了其生物學(xué)功能[5]。

近年來，納米粒子已經(jīng)成為營養(yǎng)素及藥物新劑型研究中非?；钴S的領(lǐng)域?；诓煌椒ㄖ苽涞募{米載體具有良好的生物相容性、緩釋性及靶向性，能夠有效提高營養(yǎng)素及藥物的穩(wěn)定性和生物利用率。在食品領(lǐng)域，納米載體已用作維生素、礦物質(zhì)、多肽、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物的新型輸送載體[6]。同時(shí)，應(yīng)用納米粒遞送5-氟尿嘧啶[7]、紫杉醇[8]、阿霉素[9]等抗腫瘤藥物的研究也有報(bào)道。葉酸受體在多數(shù)人體腫瘤細(xì)胞表面過度表達(dá)，而在正常細(xì)胞中很少或不表達(dá)，通過對(duì)藥物載體進(jìn)行葉酸偶聯(lián)，可以增強(qiáng)藥物與腫瘤細(xì)胞的靶向性結(jié)合，減少藥物對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用，從而提高藥物的選擇性和利用率[10]。

目前，關(guān)于通過葉酸修飾的納米載體對(duì)兒茶素進(jìn)行靶向輸送的研究尚未見報(bào)道。本研究擬通過化學(xué)反應(yīng)制備葉酸偶聯(lián)殼聚糖，然后以兒茶素為載藥，利用分子自組裝原理制備載兒茶素葉酸偶聯(lián)殼聚糖納米粒，通過響應(yīng)面法研究影響兒茶素包封率的因素并進(jìn)行工藝優(yōu)化，研究結(jié)果將為新型兒茶素輸送載體的研究開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葉酸（≥99%）、兒茶素（≥98%） 美國Sigma公司；殼聚糖（脫乙酰度≥95%，食品級(jí)）、三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，TPP）、無水二甲基亞砜、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、丙酮、氫氧化鈉、醋酸等均為分析純 上海阿拉丁試劑公司。

透析袋（截留分子質(zhì)量3 500 D） 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1004電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；78-1磁力加熱攪拌器 常州智博瑞儀器制造有限公司；TGL-18高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；754N紫外分光光度計(jì) 上海奧譜勒儀器有限公司；PHS-3E pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；VERTEX70傅里葉紅外光譜儀 德國布魯克公司；FreeZone2.5冷凍干燥機(jī) 美國Labconco公司。

1.3 方法

1.3.1 葉酸偶聯(lián)殼聚糖（folate chitosan conjugates，F(xiàn)A-CS）的制備[11]

稱取2.648 4 g葉酸和2.683 8 g 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，溶于100 mL無水二甲基亞砜，室溫下避光磁力攪拌至葉酸全部溶解。稱取2.648 4 g殼聚糖，溶于pH 4.7的0.2 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，充分?jǐn)嚢?，配制得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的殼聚糖溶液。將上述葉酸混合溶液逐滴加入殼聚糖溶液中，并持續(xù)攪拌16 h。待反應(yīng)結(jié)束后，加入1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液的pH值至9.0。然后依次用PBS（pH 7.4）、蒸餾水透析3 d，冷凍干燥得到淡黃色的FA-CS粉末。

1.3.2 葉酸偶聯(lián)比的計(jì)算[12]

1.3.2.1 葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取6.3 mg葉酸，用醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 5.8）溶解，并定容至50 mL。精確量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL上述葉酸溶液，分別置于10 mL容量瓶中，用醋酸-醋酸鈉緩沖液定容至刻度，各管中葉酸的質(zhì)量濃度分別為0.006 3、0.012 6、0.018 9、0.025 2、0.031 5、0.037 8 mg/mL。以醋酸-醋酸鈉緩沖液為對(duì)照溶液，用紫外分光光度計(jì)在358 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，葉酸的質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并得其回歸方程為：A=0.010 3C+0.017 9（R2=0.996 3）。

1.3.2.2 偶聯(lián)比的計(jì)算

稱取一定質(zhì)量?jī)龈珊蟮腇A-CS，溶解于醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 5.8），并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容至刻度，于358 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，空白溶液同上法制備。按如下公式計(jì)算每毫克FA-CS中葉酸的含量，即為偶聯(lián)比。

式中：mFA為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的葉酸質(zhì)量/mg；mFA-CS為稱取的FA-CS的質(zhì)量/mg。

1.3.3 載兒茶素葉酸偶聯(lián)殼聚糖（Catechin-FA-CS）納米粒的制備

參照Wan等[13]方法并稍作修改。稱取一定質(zhì)量的FA-CS溶解于2%醋酸溶液中配制成1.0 mg/mL的FA-CS溶液。稱取6.4 mg的兒茶素，溶解于16 mL上述FA-CS溶液中。然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至5.0，攪拌條件下將2 mL 2.0 mg/mL的TPP溶液以3 s每滴的速度滴入上述FA-CS溶液中，并持續(xù)攪拌30 min，即得Catechin-FA-CS納米粒懸浮液。將混懸液于16 000 r/min離心30 min，收集沉淀物，冷凍干燥、－20℃保存。

1.3.4 兒茶素包封率的測(cè)定

1.3.4.1 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用香草醛-鹽酸比色法[14]測(cè)定兒茶素含量。準(zhǔn)確稱取兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，用蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL棕色容量瓶中并定容至刻度，配制0.1 mg/mL的貯備液。精確量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5 mL的貯備液至10 mL的棕色容量瓶中，分別加1 mL水，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的香草醛-鹽酸溶液定容至刻度，搖勻靜置30 min，作為待測(cè)液?？瞻兹芤和戏ㄖ苽洹Ｔ?03 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定其吸光度，得到兒茶素吸光度-質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=0.085 5C+0.081 9（R2=0.996 1）。

1.3.4.2 兒茶素包封率的計(jì)算

將Catechin-FA-CS納米粒懸浮液于16 000 r/min轉(zhuǎn)速離心30 min后，收集上清液。按照上述的香草醛-鹽酸比色法操作步驟，于503 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。按如下公式計(jì)算兒茶素包封率：

式中：M總為兒茶素的初始質(zhì)量/mg；M游為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的上清液中兒茶素質(zhì)量/mg。

1.3.5 紅外光譜分析[15]

將兒茶素、CS、FA-CS和Catechin-FA-CS納米粒凍干粉末，使用溴化鉀壓片法壓片，在紅外光譜分析儀中進(jìn)行紅外光譜測(cè)試。

1.3.6 透射電鏡觀察粒子形態(tài)[16]

取一滴懸浮液，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的磷鎢酸染色劑染色2～3 min，然后置于鋪有碳支持膜的銅網(wǎng)上，用濾紙吸去多余染液，自然干燥后，置于Hitachi-7650透射電鏡下觀察，設(shè)定加速電壓為80 kV。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 單因素試驗(yàn)

稱取6.4 mg的兒茶素，設(shè)定兒茶素與FA-CS質(zhì)量比為2∶5，F(xiàn)A-CS與TPP質(zhì)量比為4∶1，反應(yīng)pH 5.0，攪拌時(shí)間30 min，固定其他條件分別考察兒茶素與FA-CS質(zhì)量比（1∶5、2∶5、3∶5、4∶5、5∶5）、FA-CS與TPP質(zhì)量比（2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1）、反應(yīng)pH值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0）和攪拌時(shí)間（10、20、30、40、50 min）對(duì)兒茶素包封率的影響。

1.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定因素水平范圍，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以兒茶素包封率為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0軟件在四因素三水平上對(duì)兒茶素/FA-CS質(zhì)量比、FA-CS/TPP質(zhì)量比、反應(yīng)pH值和攪拌時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 FA-CS的制備及結(jié)構(gòu)驗(yàn)證

2.1.1 葉酸偶聯(lián)比的計(jì)算

經(jīng)測(cè)定葉酸偶聯(lián)比為0.258，根據(jù)其分子質(zhì)量計(jì)算可知每個(gè)FA-CS分子上大約偶聯(lián)了30個(gè)葉酸分子。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在葉酸-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物上平均一個(gè)蛋白質(zhì)分子上偶聯(lián)3個(gè)葉酸分子已有較強(qiáng)的靶向性[17]。

2.1.2 FA-CS的紅外光譜分析

如圖1所示，葉酸的紅外吸收峰主要在3 419.4、1 694.5、1 604.5、1 485.0 cm－1處，分別對(duì)應(yīng)葉酸中N—H、C＝O、蝶啶環(huán)上的氨基、C＝C或C＝N的振動(dòng)吸收峰。殼聚糖主要在3 358.3、1 593.4 cm－1和1 069.2 cm－1處，分別對(duì)應(yīng)—NH2和6位—OH共同作用的振動(dòng)吸收峰、伯胺的N—H面內(nèi)變形振動(dòng)吸收和醚鍵C—O—C伸縮振動(dòng)吸收。與殼聚糖相比，F(xiàn)A-CS最明顯的變化是在1 604.3 cm－1處出現(xiàn)酰胺鍵的強(qiáng)吸收峰，1 512.2 cm－1處出現(xiàn)了仲胺N—H鍵的彎曲振動(dòng)吸收，這表明葉酸中的羧基與殼聚糖的氨基發(fā)生反應(yīng)，生成了酰胺鍵[18]，葉酸已成功偶聯(lián)于殼聚糖上。

圖1 葉酸、殼聚糖和葉酸偶聯(lián)殼聚糖的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.1 FTIR spectra of folic acid, chitosan and FA-CS

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 FA-CS/TPP質(zhì)量比對(duì)兒茶素包封率的影響

圖2 FA-CS/TPP質(zhì)量比對(duì)兒茶素包封率的影響Fig.2 Effect of FA-CS/TPP mass ratio on encapsulation efficiency of catechin

由圖2可知，隨著FA-CS/TPP質(zhì)量比增大，兒茶素的包封率逐漸增大，當(dāng)FA-CS/TPP質(zhì)量比是4∶1時(shí)，包封率達(dá)到最大值，然后呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)榧{米顆粒的形成是基于殼聚糖鏈中帶正電的氨基與TPP中多聚陰離子之間的離子凝膠化作用[19]。當(dāng)TPP濃度過高時(shí)，兩者之間的離子作用太強(qiáng)，不利于納米顆粒的形成和分散；而當(dāng)TPP濃度過低時(shí)，多聚陰離子的量又不足以與殼聚糖中氨基發(fā)生離子凝膠化作用形成納米顆粒。故選擇FA-CS/TPP的質(zhì)量比為4∶1。

2.2.2 兒茶素/FA-CS質(zhì)量比對(duì)兒茶素包封率的影響

圖3 兒茶素/FA-CS質(zhì)量比對(duì)兒茶素包封率的影響Fig.3 Effect of catechin/FA-CS mass ratio on encapsulation efficiency of catechin

由圖3可知，在兒茶素/FA-CS質(zhì)量比為1∶5時(shí)，兒茶素包封率較低；隨著兒茶素/FA-CS質(zhì)量比增大，兒茶素包封率迅速上升后又緩慢下降。當(dāng)兒茶素/FA-CS質(zhì)量比是2∶5時(shí)，包封率達(dá)到最大值23.11%。原因可能是在兒茶素質(zhì)量濃度很低的情況下，兒茶素在殼聚糖離子凝膠形成納米粒時(shí)，由于體積排阻作用被排斥到顆粒以外，導(dǎo)致包封率較低。但投藥量較高時(shí)，由于納米粒的載藥能力有限，繼續(xù)增加投藥量會(huì)使兒茶素包封率減小[20]。故選擇兒茶素/FA-CS的質(zhì)量比為2∶5。

圖4 pH值對(duì)兒茶素包封率的影響Fig.4 Effect of pH on encapsulation efficiency of catechin

2.2.3 pH值對(duì)兒茶素包封率的影響由圖4可知，pH值在3.0～7.0范圍內(nèi)，兒茶素包封率隨著pH值升高先升高后下降，當(dāng)pH值為5.0時(shí)達(dá)到最大值；隨著pH值的進(jìn)一步升高，包封率逐漸下降。原因可能是在pH值較低時(shí)，會(huì)減少TPP多聚陰離子，降低納米粒的交聯(lián)程度，導(dǎo)致兒茶素包封率較低；但pH值過高時(shí)，會(huì)極大地影響FA-CS中氨基的離子化程度，降低FA-CS正電荷數(shù)目，同樣會(huì)致使兒茶素包封率較低[21]。故選擇FA-CS溶液的pH值為5.0。

2.2.4 攪拌時(shí)間對(duì)兒茶素包封率的影響

圖5 攪拌時(shí)間對(duì)兒茶素包封率的影響Fig.5 Effect of stirring time on encapsulation efficiency of catechin

由圖5可知，攪拌時(shí)間在10～50 min范圍內(nèi)，兒茶素包封率先上升后下降，30 min時(shí)達(dá)到最高值；30～40 min時(shí)，包封率迅速下降；40～50 min時(shí)包封率下降較為平緩。這說明FA-CS與TPP的離子交聯(lián)反應(yīng)可能是一個(gè)較快的過程，在短時(shí)間內(nèi)就能完成；隨著攪拌時(shí)間的延長(zhǎng)，已經(jīng)包封的兒茶素有可能因攪拌作用而從納米粒中分散出來[22]，致使包封率下降。故選擇攪拌時(shí)間為30 min。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化Catechin-FA-CS制備工藝

2.3.1 響應(yīng)面法分析因素水平的選取

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定響應(yīng)面試驗(yàn)的因素與水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面因素水平編碼Table1 Independent variables and their levels used in response surface analysis

2.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及兒茶素包封率測(cè)定結(jié)果Table2 Experimental design and corresponding values for entrapment efficiency of catechin

采用四因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面模型，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。該試驗(yàn)共包括29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，可分為兩類：一類是析因點(diǎn)，自變量取值在各因素所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，共包括24個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)；其二是零點(diǎn)，為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。

采用Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸擬合，用以求出各影響因素的一次效應(yīng)、二次效應(yīng)及其交互效應(yīng)的關(guān)聯(lián)方程[23]，對(duì)影響兒茶素包封率的因素進(jìn)行更深入的研究和條件優(yōu)化，并做出響應(yīng)面圖。多元回歸擬合分析得到兒茶素包封率與各因素變量的二次方程模型為：Y=23.47+1.88X1－0.22X2+0.25X3+1.21X4+0.33X1X2+1.23X1X3－0.0075X1X4－0.71X2X3－0.06X2X4－0.17X3X4－3.74X12－1.70X22－1.98X32－2.52X4。

2.3.3 回歸方程方差分析

表3 回歸模型方差分析表Table3 Analysis of variance for the developed regression equation

由表3方差分析結(jié)果可知，對(duì)兒茶素包封率建立的上述回歸模型顯著水平P＜0.000 1，表明該Quadratic回歸方程模型極顯著。方程的失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），表明回歸方程對(duì)試驗(yàn)的擬合情況較好、誤差小，能較好地描述響應(yīng)值與各影響因素之間的關(guān)系。因變量與自變量之間的相關(guān)系數(shù)R2=0.962 0，模型調(diào)整決定系數(shù)R2=0.924 0，說明該模型能解釋92.40%響應(yīng)值的變化，Adj方程擬合度較高；模型的預(yù)測(cè)系數(shù)R2pred=0.824 5，表明考察值與模型預(yù)測(cè)值之間存在高度相關(guān)性。因此，可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)Catechin-FA-CS納米粒的包封率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。對(duì)各因素回歸系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)可知，一次項(xiàng)中兒茶素/FA-CS質(zhì)量比（X1）、攪拌時(shí)間（X4）以及二次項(xiàng)中X12、X22、X32、X42對(duì)兒茶素包封率均有極顯著的影響（P＜0.01）；交互項(xiàng)中兒茶素/FA-CS質(zhì)量比和pH值的交互作用對(duì)兒茶素包封率影響極顯著（P＜0.01），其他交互項(xiàng)影響不顯著。在所選的各因素水平范圍內(nèi)，各因素對(duì)兒茶素包封率的影響大小依次為：兒茶素/FA-CS質(zhì)量比（X1）＞攪拌時(shí)間（X4）＞pH值（X3）＞FA-CS/TPP質(zhì)量比（X2）。

2.3.4 響應(yīng)面分析

圖6直觀地給出了各因素交互作用對(duì)兒茶素包封率影響的響應(yīng)面和等高線圖。從響應(yīng)面的最高點(diǎn)和等值線可以看出，在每個(gè)因素選取的范圍內(nèi)，存在響應(yīng)值的極值，極值出現(xiàn)在響應(yīng)面的最高處或者等值線最小橢圓的中心點(diǎn)[24]。

圖6 各因素交互作用對(duì)兒茶素包封率的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the interactive effects of four parameters on encapsulation efficiency of catechin

在固定其他因素的情況下，隨著所考察因素值的升高，兒茶素的包封率均上升，在響應(yīng)面的最高點(diǎn)（等高線的中心點(diǎn)）達(dá)到最大值后，包封率又呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。其中，兒茶素/FA-CS質(zhì)量比（X1）對(duì)兒茶素的包封率影響最為顯著，表現(xiàn)為沿該因素軸向響應(yīng)面最為陡峭，等高線變化最密集，其次為攪拌時(shí)間（X4）；而沿pH值（X3）和FA-CS/TPP質(zhì)量比（X2）軸向的響應(yīng)面較平滑，等高線變化較稀疏，表明兩者對(duì)兒茶素包封率的影響較小。兒茶素/FA-CS質(zhì)量比和pH值的交互作用對(duì)兒茶素包封率的影響顯著，而其他交互項(xiàng)對(duì)兒茶素包封率的影響不顯著。進(jìn)一步由圖6a可知，在固定反應(yīng)pH值為5.0，攪拌時(shí)間為30 min時(shí)，兒茶素/FA-CS質(zhì)量比對(duì)兒茶素包封率的影響比FA-CS/TPP質(zhì)量比影響大，表現(xiàn)為沿X1軸方向響應(yīng)面更為陡峭，等高線密集；同樣，對(duì)于兒茶素包封率的影響，兒茶素/FA-CS質(zhì)量比＞pH值（圖6b），兒茶素/FA-CS質(zhì)量比＞攪拌時(shí)間（圖6c），pH值＞FA-CS/TPP質(zhì)量比（圖6d），攪拌時(shí)間＞FA-CS/TPP質(zhì)量比（圖6e），攪拌時(shí)間＞pH值（圖6f）。

2.3.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過回歸模型預(yù)測(cè)的最優(yōu)制備工藝為：兒茶素/FA-CS質(zhì)量比9∶20、FA-CS/TPP質(zhì)量比3.93∶1、pH 5.15、攪拌時(shí)間32.35 min。兒茶素理論包封率為23.90%，在此條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，Catechin-FA-CS納米粒中兒茶素的平均包封率為23.45%，實(shí)際值與理論預(yù)測(cè)值基本接近，且重復(fù)性良好，說明該數(shù)學(xué)模型能很好地預(yù)測(cè)各因素同包封率之間的關(guān)系。

2.4 Catechin-FA-CS納米粒的紅外光譜分析

圖7 Catechin-FA-CS納米粒及兒茶素的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.7 FTIR spectra of Catechin-FA-CS and catechin

由圖7可知，與FA-CS的紅外吸收峰（圖1）相比，F(xiàn)A-CS納米粒1 604.3 cm－1處的氨基面內(nèi)變形振動(dòng)吸收偏移至1 606.9 cm－1處，并在1 537.4 cm－1處產(chǎn)生了新的吸收峰，這表明FA-CS的氨基與TPP陰離子發(fā)生了交聯(lián)[25]。兒茶素3 316.1 cm－1和1 608.1 cm－1處為O—H和C＝C鍵的伸縮振動(dòng)，在FA-CS納米粒中相應(yīng)峰有一定增強(qiáng)。3 250 cm－1處的振動(dòng)吸收峰變寬可能是由于交聯(lián)作用，分子內(nèi)和分子間氫鍵作用增強(qiáng)而導(dǎo)致的寬化，這些結(jié)果表明兒茶素已包埋至FA-CS納米粒中。

2.5 Catechin-FA-CS納米粒的透射電鏡分析

圖8 Catechin-FA-CS納米粒的透射電鏡圖Fig.8 Transmission electron micrograph of Catechin-FA-CS particles

為進(jìn)一步驗(yàn)證兒茶素在FA-CS顆粒中的包埋情況，科研人員將Catechin-FA-CS納米粒置于透射電子顯微鏡下進(jìn)行觀察，結(jié)果見圖8。采用分子自組裝原理制備的Catechin-FA-CS納米粒形態(tài)均勻，外形較圓整，接近于規(guī)則的球形，基本無團(tuán)聚現(xiàn)象，顆粒之間稍有黏連可能是由于制樣分散不均造成。同時(shí)，電鏡結(jié)果也表明Catechin-FA-CS納米粒的粒徑分布在200～500 nm范圍內(nèi)。

3 結(jié) 論

采用分子自組裝原理制備載兒茶素葉酸偶聯(lián)殼聚糖納米粒，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，以兒茶素包封率為考察指標(biāo)，進(jìn)行工藝優(yōu)化，得到的最佳制備工藝條件為：兒茶素/FA-CS質(zhì)量比9∶20、FA-CS/TPP質(zhì)量比3.93∶1、pH 5.15、攪拌時(shí)間32.35 min。在此條件下，兒茶素包封率為23.45%，與理論值23.90%接近。紅外光譜分析證實(shí)兒茶素已包埋進(jìn)納米粒中，透射電鏡分析表明所制粒子大小較均勻，接近于規(guī)則球形，分布在200～500 nm范圍內(nèi)。利用響應(yīng)面法優(yōu)化載兒茶素葉酸偶聯(lián)殼聚糖納米粒的制備工藝是可行的。

[1]KIDD P M.Bioavailability and activity of phytosome complexes from botanical polyphenols: the silymarin, curcumin, green tea, and grape seed extracts[J].Alternative Medicine Review, 2009, 14(3): 226-246.

[2]楊宇清, 魏偉.兒茶素對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)性超敏反應(yīng)的影響[J].中國新藥雜志, 2007, 16(23): 1940-1943.

[3]劉珊麗, 劉宗文, 盧沛琦, 等.兒茶素對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制[J].中國藥理學(xué)通報(bào), 2010, 26(2): 255-257.

[4]LIPINSKI C A, LOMBARDO F, DOMINY B W, et al.Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings[J].Advanced Drug Delivery Reviews, 2012, 64: 4-17.

[5]SANG S, LAMBERT J D, YANG C S.Bioavailability and stability issues in understanding the cancer preventive effects of tea polyphenols[J].Journal of the Science of Food and Agriculture, 2006,86(14): 2256-2265.

[6]XIA Shuqin, XU Shiying.Ferrous sulfate liposomes: preparation,stability and application in fluid milk[J].Food Research International,2005, 38(3): 289-296.

[7]LAI Lingfeng, GUO Hongxia.Preparation of new 5-fluorouracilloaded zein nanoparticles for liver targeting[J].International Journal of Pharmaceutics, 2011, 404(1): 317-323.

[8]AKHLAGHI S P, SAREMI S, OSTAD S N, et al.Discriminated effects of thiolated chitosan-coated pMMA paclitaxel-loaded nanoparticles on different normal and cancer cell lines[J].Nanomedicine:Nanotechnology, Biology and Medicine, 2010, 6(5): 689-697.

[9]TAN Yulong, LIU Chenguang.Preparation and characterization of selfassemblied nanoparticles based on folic acid modified carboxymethyl chitosan[J].Journal of Materials Science: Materials in Medicine, 2011,22(5): 1213-1220.

[10]龔金蘭, 汪森明, 胡喜鋼, 等.腫瘤靶向性藥物載體葉酸-殼聚糖微球的制備及特性研究[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 28(12): 2183-2186.

[11]LI Puwang, WANG Yichao, ZENG Fanbo, et al.Synthesis and characterization of folate conjugated chitosan and cellular uptake of its nanoparticles in HT-29 cells[J].Carbohydrate Research, 2011, 346(6):801-806.

[12]趙穎, 楊琰, 盧實(shí), 等.不同連接比例葉酸偶聯(lián)殼聚糖的制備[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 31(5): 385-387.

[13]WAN Ajun, SUN Yan, LI Huili.Characterization of folate-graftchitosan as a scaffold for nitric oxide release[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2008, 43(5): 415-421.

[14]SUN B, RICARDO-DA-SILVA J M, SPRANGER M.Critical factors of vanillin assay for catechins and proanthocyanidins[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1998, 46(10): 4267–4274.

[15]金鑫, 張陽德, 王吉偉, 等.熒光標(biāo)記的葉酸修飾殼聚糖納米載體研制[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 41(1): 161-165.

[16]梁進(jìn).納米茶多酚的制備及其抗腫瘤作用研究[D].南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011.

[17]LU Y, LOW P S.Folate-mediated delivery of macromolecular anticancer therapeutic agents[J].Advanced Drug Delivery Reviews,2002, 54(5): 675-693.

[18]蔣挺大.甲殼素[M].北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2004: 33-38.

[19]BARBARA K.Application of chitin- and chitosan-based materials for enzyme immobilizations: a review[J].Enzyme and Microbial Technology, 2004, 35(2): 126-139.

[20]JI Jingou, WU Danjun, LIU Li, et al.Preparation, evaluation, and in vitro release of folic acid conjugated O-carboxymethyl chitosan nanoparticles loaded with methotrexate[J].Journal of Applied Polymer Science, 2012, 125(S2): 208-215.

[21]JI Jingou, WU Danjun, LIU Li, et al.Preparation, characterization, and in vitro release of folic acid-conjugated chitosan nanoparticles loaded with methotrexate for targeted delivery[J].Polymer Bulletin, 2011,68(6): 1707-1720.

[22]麻成金, 吳竹青, 傅偉昌, 等.響應(yīng)面法優(yōu)化仿栗籽油超臨界萃取工藝[J].食品科學(xué), 2011, 31(18): 196-202.

[23]KALIL S J, MAUGERI F, RODRIGUES M I.Response surface analysis and simulation as a tool for bioprocess design and optimization[J].Process Biochemistry, 2000, 35(6): 539-550.

[24]高義霞, 景紅艷, 姜祖君, 等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化乳苣總黃酮提取工藝的研究[J].中藥材, 2010, 33(4): 621-624.

[25]WU Yan, YANG Wuli, WANG Changchun, et al.Chitosan nanoparticles as a novel delivery system for ammonium glycyrrhizinate[J].International Journal of Pharmaceutics, 2005,295(1): 235-245.