王 燕，王春偉,，高 潔,*，崔麗麗

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130112）

烯酰嗎啉即4-[3-（4-氯苯基）-3-（3,4-二甲氧基苯基）丙烯酰]嗎啉，是一種肉桂酸衍生物，為專一殺卵菌綱真菌殺菌劑，其作用機(jī)制是破壞病菌細(xì)胞壁膜的形成，引起孢子囊壁的分解使病菌死亡，可用于防治多種作物霜霉屬和疫霉屬病菌引起的病害[1-2]。人參疫病是由卵菌門疫霉屬惡疫霉菌（Phytophthora cactorum）侵染所致[3]，該病在人參產(chǎn)區(qū)分布廣泛，是人參生育期內(nèi)最嚴(yán)重的病害之一，可發(fā)生多次再侵染，嚴(yán)重時(shí)發(fā)病率可達(dá)70%以上，造成參苗大面積受害死亡[4]。目前烯酰嗎啉已廣泛用于人參疫病的防治，且與甲霜靈、苯霜靈等苯基酰胺類殺菌劑無(wú)交互抗性[5]。

近年來(lái)，歐盟、美國(guó)、日本等國(guó)家和地區(qū)相繼制定了越來(lái)越嚴(yán)格的食品安全法規(guī)和農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，農(nóng)藥殘留問(wèn)題已成為我國(guó)包括人參在內(nèi)的眾多農(nóng)產(chǎn)品出口受阻的主要原因。烯酰嗎啉殘留量的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法[2,6-8]、液相色譜法[9]、氣相色譜-質(zhì)譜法[10-13]、液相色譜-質(zhì)譜法[14-17]等，而采用高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定人參中烯酰嗎啉的殘留動(dòng)態(tài)及最終殘留量，并對(duì)其可能產(chǎn)生的膳食安全風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。

人參基質(zhì)成分復(fù)雜，包括多種皂甙、有機(jī)酸、多糖等，若采用傳統(tǒng)色譜分析手段，其樣品凈化困難，在檢測(cè)過(guò)程中易產(chǎn)生假陽(yáng)性。高效液相色譜-質(zhì)譜（high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，HPLC-MS-MS）是以質(zhì)譜儀為檢測(cè)手段，集高效液相色譜高分離能力與質(zhì)譜高靈敏度和高選擇性于一體的分離分析方法，具有靈敏度高、廣譜性強(qiáng)、抗干擾好等優(yōu)點(diǎn)，可利用色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜特征離子對(duì)及其相對(duì)豐度比等多重因素進(jìn)行準(zhǔn)確定性，與傳統(tǒng)的色譜分析方法相比，定量測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確、陽(yáng)性結(jié)果確證更加可靠。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)人參樣品基質(zhì)的特性，對(duì)提取、凈化等前處理步驟進(jìn)行了優(yōu)化，建立了人參根、莖、葉和土壤中烯酰嗎啉的高效液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)方法，研究烯酰嗎啉在人參根、莖、葉及土壤中的消解動(dòng)態(tài)及最終殘留量，并對(duì)其可能產(chǎn)生的膳食安全風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估，為烯酰嗎啉在人參上的安全合理使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試農(nóng)藥：質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%的烯酰嗎啉水分散粒劑陜西標(biāo)正作物科學(xué)有限公司；供試作物：4 年生人參，品種為大馬牙，試驗(yàn)地點(diǎn)：吉林省撫松縣興參鎮(zhèn)榆樹(shù)村人參種植基地和集安市榆林鎮(zhèn)大地參業(yè)人參種植基地。

甲苯、丙酮、乙腈（優(yōu)級(jí)純） 美國(guó)Tedia公司；甲酸（色譜純） 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；烯酰嗎啉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度為99.0%） 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息中心；ProElut人參農(nóng)藥殘留（ginseng pesticides residue，GPR，粒徑1.5 g/12 mL）固相萃取柱 北京Dikma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

API 4000三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀 美國(guó)AB公司；1200高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；Kromasil Eternity-5-C18色譜柱 瑞典Akzo Nobel公司；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Büchi公司；X-22R離心機(jī)（10 000 r/min）美國(guó)Beckman Coulter有限公司；Vortex.Genie 2渦旋混勻器 德國(guó)IKA公司；LC51-GM200刀式混合碾磨儀（10 000 r/min） 德國(guó)Retsch公司；Milli-QA10超純水器 美國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)共設(shè)高劑量和不施藥空白對(duì)照2個(gè)處理，3次重復(fù)，小區(qū)面積為15 m2。施藥時(shí)期為人參展葉后期，2012年7月31日。施藥劑量為800 g a.i./hm2。施藥后0（施藥后2 h之內(nèi)）、1、3、7、14、21、28 d和35 d分別采集人參根、莖、葉及土壤樣品，每小區(qū)按對(duì)角線取5 點(diǎn)，土壤樣品取土深度為0～10 cm。

最終殘留實(shí)驗(yàn)共設(shè)低劑量、高劑量和不施藥空白對(duì)照3個(gè)處理，施藥劑量分別為800 g a.i./hm2和533.33 g a.i./hm2，設(shè)3次重復(fù)，小區(qū)面積為15 m2，在施藥后28、35 d和60 d采集人參根、莖、葉和土壤樣品，每小區(qū)按對(duì)角線取5 點(diǎn)，土壤樣品取土深度為0～15 cm。

采樣方法：每小區(qū)按對(duì)角線取5 點(diǎn)，土壤樣品取土深度為0～10 cm，四分法留樣。同期采集空白樣品，標(biāo)簽標(biāo)記后于－20℃條件下保存待測(cè)[18]。

1.3.2 樣品前處理

樣品的制備：稱取鮮人參根、莖、葉樣品各100 g，依次用混合碾磨儀將樣品粉碎后，于－20℃保存?zhèn)溆?。取土壤樣品不少?00 g，過(guò)0.25 mm孔徑篩，混勻，于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

提?。悍謩e準(zhǔn)確稱取5 g人參根、莖、葉及土壤樣品置于50 mL離心管中，加入20 mL丙酮后用渦旋混勻器混合1 min，8 000 r/min離心5 min，取上清液，再向離心管中加入20 mL丙酮，重復(fù)提取一次，合并上清液于35℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入乙腈-甲苯（3∶1，V/V）5 mL溶解，待凈化。

凈化：10 mL乙腈-甲苯（3∶1，V/V）預(yù)淋洗GPR固相萃取柱，流出液棄去。將5 mL樣品提取溶解液傾入GPR固相萃取柱中，用20 mL乙腈-甲苯（3∶1，V/V）進(jìn)行洗脫。收集全部洗脫液于雞心瓶中，于35℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至近干。用乙腈溶解，并定容至1 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后供LC-MS-MS測(cè)定。

1.3.3 儀器條件

色譜柱：Kromasil Eternity-5-C18柱（2.1 mm×150 mm，0.5 μm）；流動(dòng)相：V（乙腈）∶V（水）∶V（甲酸）=90.00∶9.99∶0.01；流速250 μL/min；柱溫度40℃；進(jìn)樣量10 μL。

電離方式為電噴霧電離（electron spray ionization，ESI）源；電噴霧電壓5 500 V；霧化氣壓力0.483 MPa；氣簾氣壓力0.138 MPa；輔助加熱氣壓力0.379 MPa；離子源溫度725℃；掃描方式為正離子掃描；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

準(zhǔn)確稱取烯酰嗎啉標(biāo)準(zhǔn)品，置于100.0 mL容量瓶中，用丙酮配制成質(zhì)量濃度100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用人參空白基質(zhì)液稀釋、定容，配制成質(zhì)量濃度為0.001、0.005、0.01、0.05、0.10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.3.5 烯酰嗎啉在人參中的膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

依照所建立的方法對(duì)人參樣品中烯酰嗎啉的殘留量進(jìn)行檢測(cè)，其膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果分別由公式（1）和（2）[19]計(jì)算得出：

楊大進(jìn)等[20]經(jīng)調(diào)查得出我國(guó)60 kg體質(zhì)量成人的中藥材保健食品每日攝入量約為0.000 57 kg，烯酰嗎啉每日允許攝入量（acceptable daily intake，ADI）值為0.20 mg/kg bw[21]，理論殘留量以2地實(shí)驗(yàn)高劑量下人參根中最終殘留量的平均值計(jì)，以人均體質(zhì)量60 kg計(jì)，計(jì)算烯酰嗎啉在人參上的估計(jì)暴露量和風(fēng)險(xiǎn)商值。

當(dāng)風(fēng)險(xiǎn)商值大于1時(shí)，表示存在不可接受的風(fēng)險(xiǎn)，數(shù)值越大，風(fēng)險(xiǎn)越大；風(fēng)險(xiǎn)商值小于1時(shí)，表示風(fēng)險(xiǎn)為可以接受，數(shù)值越小，風(fēng)險(xiǎn)越小[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的選擇

本研究采用極性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑提取，以丙酮、乙腈、甲醇作為提取溶劑進(jìn)行選擇實(shí)驗(yàn)。其中，甲醇做提取劑時(shí)，乳化現(xiàn)象嚴(yán)重，8 000 r/min 離心10 min仍不能消除乳化現(xiàn)象，因此重點(diǎn)考察了丙酮和乙腈的提取效果。研究發(fā)現(xiàn)，2種提取溶劑中，丙酮提取效率為92.0%，乙腈為81.5%，丙酮對(duì)烯酰嗎啉的提取效率明顯高于乙腈，故用丙酮提取。

2.2 凈化條件的選擇

采用目前殘留檢測(cè)中應(yīng)用最廣泛的固相萃取（solid phase extraction，SPE）法。SPE法所需樣品量少，避免了乳化現(xiàn)象，且回收率高、重復(fù)性好。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中選擇GPR固相萃取柱，乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）固相萃取柱，活性碳固相萃取柱，弗羅里硅土柱和十八烷基硅烷鍵合相（C18）固相萃取柱進(jìn)行凈化。結(jié)果表明，烯酰嗎啉采用GPR固相萃取柱凈化效果最好（表1）。

表1 不同SPE柱中的烯酰嗎啉回收率Table1 Effects of different solid phase extraction cartridges on the recovery of dimethomorph

2.3 洗脫溶劑體積的選擇

洗脫溶劑體積直接影響目標(biāo)分析物能否被洗脫下來(lái)。圖1為乙腈-甲苯（3∶1，V/V）洗脫的洗脫曲線圖，從洗脫曲線可知：烯酰嗎啉在GPR固相萃取柱上在0～18 mL時(shí)流出。因此，本方法確定收集20 mL洗脫液則可最大程度地除去基質(zhì)干擾物的同時(shí)保證農(nóng)藥組分的回收率符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求。

圖1 乙腈-甲苯洗脫曲線圖Fig.1 Cumulative recovery of dimethomorph eluted by acetonitrile/methylbenzene

2.4 色譜條件的優(yōu)化

同一樣品在不同填料的色譜柱上分離效果不同，通過(guò)對(duì)安捷倫公司、迪馬公司、沃特斯等公司生產(chǎn)的不同型號(hào)的C18色譜柱進(jìn)行對(duì)比，最終選擇瑞典AKZO NOBEL公司生產(chǎn)的Kromasil Eternity-5-C18色譜柱。Kromasil是一種高純度球形硅膠填料，含碳量高，表面極性小，分離效能高，能有效降低金屬螯合物在硅膠基質(zhì)上的絡(luò)合效應(yīng)，具有重復(fù)性好，適用性廣，使用壽命長(zhǎng)的特點(diǎn)。另外，流動(dòng)相的組成不僅會(huì)影響到目標(biāo)化合物的保留時(shí)間和峰形，還會(huì)影響到離子化效率，從而影響靈敏度。選擇流動(dòng)相為乙腈-水或甲醇-水進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以乙腈和水為流動(dòng)相各信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度優(yōu)于甲醇，所以選用乙腈和水來(lái)做為流動(dòng)相。甲酸的加入利于目標(biāo)物的質(zhì)子化，因而可以提高靈敏度，但過(guò)量甲酸的加入則會(huì)反過(guò)來(lái)抑制目標(biāo)物的質(zhì)子化，進(jìn)而降低靈敏度。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了甲酸的加入量，結(jié)果表明，流動(dòng)相為V（乙腈）∶V（水）∶V（甲酸）=90.00∶9.99∶0.01時(shí)效果最好，色譜峰對(duì)稱尖銳，峰形良好。

2.5 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用流動(dòng)注射泵連續(xù)進(jìn)樣方式進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化，在ESI正離子模式下進(jìn)行全掃描，確定母離子后，優(yōu)化去簇電壓，再進(jìn)行子離子掃描，同時(shí)優(yōu)化碰撞氣能量，根據(jù)歐盟2002/657/EC指令對(duì)殘留確認(rèn)方法的要求，對(duì)于高效液相色譜-質(zhì)譜，至少需要一個(gè)母離子和兩個(gè)子離子才能定性確證。選擇離子豐度較強(qiáng)、干擾較小的兩個(gè)子離子，進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM），并對(duì)質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化（表2）。

表2 質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)Table2 Optimized MS parameters

2.6 樣品基質(zhì)效應(yīng)的消除

電噴霧離子源易受樣品基質(zhì)影響，樣品基質(zhì)對(duì)離子化可能存在抑制作用。為消除樣品基質(zhì)效應(yīng)，本研究分別以人參根、莖、葉及土壤的空白樣品提取液配制不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用來(lái)定量測(cè)定人參根、莖、葉和土壤中烯酰嗎啉殘留量，以保證標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液具有同樣的離子化條件，從而消除樣品基質(zhì)效應(yīng)。

2.7 線性范圍及最低檢出限

烯酰嗎啉在0.001～0.10 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），得到線性方程為y=3.05×103x+1.05×104，R2=0.999 9。在所設(shè)定的儀器條件下，以3倍信噪比（RSN=3）計(jì)算檢出限，烯酰嗎啉的最低檢出限為0.001 mg/kg。

2.8 添加回收率測(cè)定

表3 烯酰嗎啉的添加回收率（n=10）Table3 Recoveries of dimethomorph (n= 10)

在0.01～0.20 mg/kg添加范圍內(nèi)，烯酰嗎啉在人參根、莖、葉及土壤中的添加回收率分別82.4%～95.5%、82.0%～95.1%、88.1%～91.3%、87.1%～93.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.01%～7.66%、5.05%～6.18%、5.85%～7.67%、5.39%～6.26%，結(jié)果見(jiàn)表3，符合殘留實(shí)驗(yàn)要求。烯酰嗎啉標(biāo)準(zhǔn)品MRM色譜圖（0.01 mg/kg），人參空白樣品MRM色譜圖和人參添加樣品MRM色譜圖（0.01 mg/kg）分別見(jiàn)圖2～4。

圖2 烯酰嗎啉標(biāo)準(zhǔn)品MRM色譜圖（0.01 mg/kg）Fig.2 MRM chromatogram of dimethomorph standard (0.01 mg/kg)

圖3 人參空白樣品MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatogram of ginseng blank samples

圖4 人參添加樣品MRM色譜圖（0.01 mg/kg）Fig.4 MRM chromatogram of spiked ginseng sample (0.01 mg/kg)

2.9 殘留動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)

由表4可知，通過(guò)在集安市和撫松縣兩地進(jìn)行的殘留動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%的烯酰嗎啉水分散粒劑在人參根、莖、葉和土壤中的降解動(dòng)態(tài)符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程Ct=C0e－Kt。式中：Ct為施藥后間隔時(shí)間t時(shí)農(nóng)藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)；C0為施藥后的原始沉積量；K為降解速率常數(shù)；t為施藥后的時(shí)間。由此可求出降解半衰期t1/2=ln2·K－1。烯酰嗎啉的原始沉積量從大到小依次為葉＞莖＞土壤＞根，在人參的根、莖、葉及土壤中的半衰期均在9.13～16.35 d之間，半衰期較短，屬于易降解農(nóng)藥（t1/2＜30 d）。

表4 烯酰嗎啉在人參根、莖、葉和土壤中消解動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table4 Kinetic degradation parameters of dimethomorph in ginseng root, stem, leaf and soil

2.10 最終殘留實(shí)驗(yàn)

表5 烯酰嗎啉在人參根、莖、葉及土壤中的最終殘留Table5 Final residues of dimethomorph in ginseng root, stem, leaf and soil mg/kg

由表5可知，通過(guò)在集安市和撫松縣兩地進(jìn)行的最終殘留實(shí)驗(yàn)，施藥后28、35、60 d烯酰嗎啉在人參根、莖、葉和土壤中的殘留量分別為未檢出～0.024 5、0.023 3～0.138 7、0.121 5～0.618 2 mg/kg和0.008 4～0.073 8 mg/kg。

2.11 烯酰嗎啉在人參中的膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%的烯酰嗎啉水分散粒劑在人參中估計(jì)暴露量為7.13×10－8mg/kg，風(fēng)險(xiǎn)商值為3.56×10－7（遠(yuǎn)小于1），在施藥劑量為533.33～800 g a.i./hm2，在一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)施用1次，膳食風(fēng)險(xiǎn)較低，對(duì)消費(fèi)者安全。

3 結(jié) 論

本研究建立了人參根、莖、葉及土壤中烯酰嗎啉的高效液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)方法。該方法操作簡(jiǎn)便、快捷，具有較好的精密度、靈敏度、準(zhǔn)確度，完全滿足農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求。殘留動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：烯酰嗎啉在人參根、莖、葉和土壤中的降解半衰期為9.13～16.35 d，屬于易降解農(nóng)藥（t1/2＜30 d）。

我國(guó)尚未制定烯酰嗎啉在人參中的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，歐盟規(guī)定烯酰嗎啉在人參上的最大殘留限量值為0.05 mg/kg[22]，韓國(guó)規(guī)定烯酰嗎啉在鮮人參和干人參中的最大殘留限量值分別為3.00 mg/kg和15.00 mg/kg[23]，我國(guó)規(guī)定烯酰嗎啉在蔬菜和水果中的最大殘留限量值為0.05～5.00 mg/kg[20]。參照以上殘留限量規(guī)定及殘留實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，建議質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%的烯酰嗎啉水分散粒劑在人參上的最大殘留限量值可暫定為0.05 mg/kg，安全間隔期為28 d。質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%的烯酰嗎啉水分散粒劑在人參生長(zhǎng)期施藥1次，施藥量為800 g a.i./hm2時(shí)，風(fēng)險(xiǎn)商值為3.56×10－7（遠(yuǎn)小于1），膳食風(fēng)險(xiǎn)較低，人參在收獲后入藥及食用是安全的。

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