高危型人乳頭瘤病毒E6/E7 mRNA在宮頸病變篩查中的作用研究

劉佳佳，馮 姝，瞿全新，唐榮榮，李 敏

宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)是與宮頸浸潤癌密切相關的一組癌前病變，反映了宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的連續(xù)過程。從CIN發(fā)展為宮頸癌一般需要10～15年。因此，高效篩查是早期發(fā)現(xiàn)病變、指導及時恰當治療和隨訪管理、有效預防宮頸癌發(fā)生的關鍵。目前，宮頸液基薄層細胞學檢查(TCT)是宮頸癌篩查中應用最為廣泛的方法，但是,該方法不能單獨用于區(qū)分少數(shù)可能進展為浸潤癌的病變和絕大多數(shù)可能自然消退的病變[1-2]。20世紀70年代德國病毒學家Zur Hausen提出人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV) 與宮頸癌發(fā)病密切相關的假設以來，大量研究表明HPV感染，特別是高危型HPV持續(xù)感染是絕大多數(shù)宮頸癌前病變和宮頸癌的主要原因[3]。進行HPV DNA檢測可提高高級別CIN及宮頸癌的檢出率，對細胞學檢查結果可疑患者的分類及癌前病變治療后隨訪具有重要意義[4]?？焖賹Я麟s交芯片可進行HPV分型檢測，為當前應用較為廣泛的HPV檢測技術，臨床多與宮頸TCT聯(lián)合應用。然而，多數(shù)HPV感染都是無癥狀和暫時性的，且大多數(shù)新發(fā)感染可在2年內消退[5]，這使得HPV DNA檢測雖然具有較高的敏感度，但特異度相對較低[6]，意味著HPV DNA檢測可能檢出過多臨床無意義感染，從而增加患者經(jīng)濟負擔和心理負擔。本研究旨在探討高危型HPV E6/E7 mRNA檢查是否能更好地預測宮頸癌前病變進展，從而為臨床篩查及患者隨訪管理方面提供新方法。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2011年6月—2012年7月因宮頸疾病在天津醫(yī)科大學一中心臨床學院 天津市第一中心醫(yī)院婦產(chǎn)科就診的74例患者為研究對象，年齡22～77歲，平均38.1歲。多以接觸性出血或異常陰道出血、白帶異常、下腹隱痛就診。均無CIN史、宮頸癌史及盆腔放射治療史，無子宮全切術史，目前無妊娠，取材前3 d內無陰道沖洗及用藥史。所有患者行宮頸TCT、陰道鏡下活檢組織病理學檢查。

1.2 宮頸樣本采集 采用凱普宮頸細胞收集保存系統(tǒng)及專用去RNA酶宮頸細胞保存系統(tǒng)分別采集每例患者宮頸細胞標本共2份，將刷頭放入相應的取樣管中，取樣管內含專用細胞保存液，擰緊瓶蓋，室溫保存待測。

1.3 實驗器材與試劑 超凈工作臺、聚合酶鏈式反應(PCR)擴增儀、HybriMax醫(yī)用核酸分子快速雜交儀、離心機、水浴鍋、移液器；HPV DNA提取試劑盒、PCR擴增試劑盒、HPV DNA雜交試劑盒，購自凱普生物化學有限公司；QuantiVirusTMHPV mRNA診斷試劑盒購自科蒂亞(新鄉(xiāng))生物技術有限公司。

1.4 宮頸TCT與陰道鏡下活檢組織病理學檢查 宮頸TCT為常規(guī)篩查手段，其檢查結果異?！舱槲匆娚掀炔∽兗毎?NILM)，異常為非典型鱗狀細胞(ASC-US)、低度鱗狀上皮內病變(LSIL)〕患者，于陰道鏡檢查下取活檢，送病理科行組織病理學檢查，以病理檢查報告為金標準。

1.5 高危型HPV E6/E7 mRNA檢測 按照試劑盒要求進行操作，主要步驟包括裂解細胞、雜交捕獲mRNA、信號放大、底物發(fā)光反應，經(jīng)QuantiVirusTM冷光儀檢測，檢測結果為光子數(shù)，經(jīng)Diacarta公司計算機軟件計算轉換后自動判斷結果。

1.6 HPV DNA分型檢測 按試劑盒要求進行操作，主要步驟包括全基因組DNA提取、PCR、導流雜交，通過肉眼進行判斷，檢測結果陽性點為清晰可見的藍紫色圓點，根據(jù)雜交膜的HPV亞型分布圖，判斷陽性點為何種HPV亞型感染，一個圓點為HPV亞型單一感染，兩個及以上即為多重感染。另外，每張芯片上都有一個內照點(PCR放映質控點)和生物素對照點(雜交顯色質控點)。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料及敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 病理學檢查結果 陰道鏡下活檢組織病理學檢查慢性宮頸炎患者20例，年齡34～54歲；CIN患者42例，其中CINⅠ10例，年齡30～61歲，CINⅡ12例，年齡22～56歲，CIN Ⅲ 20例，年齡24～58歲；宮頸癌患者12例，年齡23～65歲。根據(jù)病理結果進行合并：慢性宮頸炎及CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ、宮頸癌。

2.2 高危型HPV E6/E7 mRNA檢測與HPV DNA分型檢測在宮頸病變中的檢出率 高危型HPV E6/E7 mRNA檢測與HPV DNA分型檢測宮頸病變總檢出率分別為60.8%(45/74)和66.2%(49/74)，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.467，P>0.05)。兩種方法檢測慢性宮頸炎及CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ、宮頸癌檢出率比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表1)。

2.3 高危型HPV E6/E7 mRNA檢測與HPV DNA分型檢測對高級別宮頸病變的診斷 CINⅡ及以上的宮頸病變定義為高級別宮頸病變，以病理學檢查為金標準，高危型HPV E6/E7 mRNA檢測與HPV DNA分型檢測高級別宮頸病變的敏感度、陽性預測值、陰性預測值比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；兩組特異度比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2～4)。

表1 兩種檢測方法宮頸病變檢出率比較〔n(%)〕

Table1 Comparison of the detection rate of cervical lesions between the two methods

方法例數(shù)慢性宮頸炎及CINⅠCINⅡ～Ⅲ宮頸癌高危型HPVE6/E7mRNA檢測74 5(68) 29(392)11(149)HPVDNA分型檢測7412(162)28(378) 9(122) χ2值325600280231P值007108660631

注：HPV=人乳頭瘤病毒，CIN=宮頸上皮內瘤變

表2 高危型HPV E6/E7 mRNA檢測與病理學檢查高級別宮頸病變比較(例)

Table2 Comparison of high-risk HPV E6 /E7 mRNA testing and pathology report in predicting advanced cervical lesions

高危型HPVE6/E7mRNA檢測病理學檢查陽性 陰性合計陽性40 5 45陰性 4 2529合計443074

表3 HPV DNA分型檢測與病理學檢查高級別宮頸病變比較(例)

Table3 Comparison of HPV DNA testing and pathology report in predicting advanced cervical lesions

HPVDNA分型檢測病理學檢查陽性 陰性合計陽性371249陰性 7 1825合計443074

表4 兩種方法檢測高級別宮頸病變的靈敏度、特異度、陽性預測值及陰性預測值比較(%)

Table4 Comparison of sensitivity,specificity,positive predictive value and negative predictive value of the two methods in predicting advanced cervical lesions

方法敏感度特異度陽性預測值陰性預測值高危型HPVE6/E7mRNA檢測909833889862HPVDNA分型檢測841600755720χ2值0935402228341671P值0330004500900196

2.4 高危型HPV E6/E7 mRNA檢測與HPV DNA分型檢測對ASC-US患者高級別宮頸病變的診斷 25例患者宮頸TCT結果為ASC-US，高危型HPV E6/E7 mRNA檢測與HPV DNA分型檢測ASC-US患者高級別宮頸病變的敏感度、陽性預測值、陰性預測值比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；兩組特異度比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表5～7)。

表5 高危型HPV E6/E7 mRNA檢測與病理學檢查ASC-US患者高級別宮頸病變比較(例)

Table5 Comparison of high-risk HPV E6 /E7 mRNA testing and pathology report in predicting advanced cervical lesions in patients with ASC-US

高危型HPVE6/E7mRNA檢測病理學檢查陽性 陰性合計陽性12 1 13陰性 1 1112合計131225

注：ASC-US=非典型鱗狀細胞

表6 HPV DNA分型檢測與病理學檢查ASC-US患者高級別宮頸病變比較(例)

Table6 Comparison of HPV DNA testing and pathology report in predicting advanced cervical lesions in patients with ASC-US

HPVDNA分型檢測病理學檢查陽性 陰性合計陽性11 6 17陰性 2 6 8 合計131225

表7 兩種方法檢測ASC-US患者高級別宮頸病變的靈敏度、特異度、陽性預測值及陰性預測值比較(%)

Table7 Comparison of sensitivity,specificity,positive predictive value and negative predictive value of the two methods in predicting advanced cervical lesions in patients with ASC-US

方法敏感度特異度陽性預測值陰性預測值高危型HPVE6/E7mRNA檢測923917923917HPVDNA分型檢測846500647750χ2值0377504231371046P值0539002500770306

3 討論

3.1 高危型HPV E6/E7 mRNA檢測在宮頸病變中的作用 目前，以DNA為基礎的HPV檢測在宮頸病變篩查中發(fā)揮重要作用[7-8]，但是HPV DNA檢測可以檢出大量的暫時性感染，這些感染通常對預測病變的風險無實際意義。盡管DNA檢測具有較高的敏感度和陰性預測值，但其陽性預測值較低[9]。隨著對E6、E7癌蛋白在宮頸癌致癌機制中的作用逐漸明了，許多研究者提出對E6、E7癌蛋白表達過程中反映其轉錄活性的E6/E7 mRNA進行檢測可能更能預測病情的進展[10-11]。

本研究對74例宮頸疾病患者分別進行了高危型HPV E6/E7 mRNA檢測和HPV DNA分型檢測，結果證實，HPV E6/E7 mRNA檢測和DNA檢測宮頸病變總檢出率分別為60.8%和66.2%，兩種方法間無差異。兩種方法檢測慢性宮頸炎及CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ、宮頸癌的檢出率比較亦無差異。高危型HPV E6/E7 mRNA檢測與HPV DNA分型檢測高級別宮頸病變比較，靈敏度、陽性預測值、陰性預測值間無差異，而高危型HPV E6/E7 mRNA檢測特異度為83.3%，明顯高于HPV DNA分型檢測的60.0%。HPV DNA分型檢測可早期發(fā)現(xiàn)有進展風險的持續(xù)性感染，并能夠識別可能消退的病變，避免對患者的過度檢查與治療，減少患者的心理負擔及經(jīng)濟負擔。

3.2 高危型HPV E6/E7 mRNA檢測在ASC-US患者分流中的作用 目前，宮頸TCT為ASC-US的患者臨床處理較為棘手，臨床多對其進行HPV DNA分型檢測，其結果已作為對ASC-US患者分流的重要標準。美國國立腫瘤研究院對ASC-US患者進行多中心研究顯示，HPV DNA分型檢測對發(fā)現(xiàn)CIN及以上病變的敏感度為96.3%，其中僅有56.1%的患者需要進行陰道鏡下宮頸活組織檢查。而對ASC-US患者進行HPV DNA分型檢測可能導致過多患者進行不必要的陰道鏡及宮頸活組織檢查，給患者造成不必要的傷害和負擔。本研究對25例宮頸TCT為ASC-US患者進行分析，證實高危型HPV E6/E7 mRNA檢測的特異度為91.7%，明顯高于HPV DNA分型檢測的50.0%。通過檢測患者宮頸標本中高危型HPV E6/E7 mRNA表達，可在一定程度上反應高危型HPV E6、E7癌蛋白表達和病變活躍程度。高危型HPV E6/E7 mRNA檢測相對更高的特異度決定了其排除可疑或低度病變的能力更強，能夠把更多無進展性的病變重新歸入常規(guī)的篩查程序中，有效減少對疾病程度的誤判，避免過度檢查、治療給患者帶來的痛苦和精神負擔。而在靈敏度、陽性預測值、陰性預測值方面的比較無差異。高危型HPV E6/E7 mRNA檢測與HPV DNA分型檢測相當?shù)拿舾卸纫脖ＷC了對ASC-US高級別病變具有較高的辨別能力，使其漏診的風險并不比HPV DNA分型檢測增加，另一方面，與HPV DNA分型檢測相似的陽性預測值和陰性預測值也保證其判定有無病變進展高危風險的準確性，具有較高的診斷可信度。

因此，本研究認為高危型HPV E6/E7 mRNA檢測對ASC-US的分流意義更為明確，可有效指導陰道鏡的合理使用。但由于研究涉及樣本量較小，同時由于選取樣本的限制，導致高危型HPV檢出率可能較正常人群更高，因此仍需要進一步的深入研究。

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