鄭力恒 林宏生 張國威 李錦聰 謝林 張大衛(wèi)

甲基潑尼松龍對急性期脊髓損傷 bcl-2 等凋亡基因的影響

鄭力恒 林宏生 張國威 李錦聰 謝林 張大衛(wèi)

目的 觀察甲基潑尼松龍 ( methylprednisolone，MP ) 干預(yù)對急性期脊髓損傷凋亡相關(guān)基因bcl-2、bax、cytc 和 caspass-9 相對表達(dá)量的影響，并探討該藥物促進(jìn)脊髓功能修復(fù)的機(jī)制。方法 實驗動物隨機(jī)分為假手術(shù)組 ( S 組 )、單純損傷組 ( C 組 ) 與 MP 治療組 ( T 組 ) 各 36 只，采用改良 Allen’s 法制作急性脊髓損傷模型，在損傷后 8 h、24 h、3 天、7 天、14 天和 28 天隨機(jī)取各組 6 只動物處死，實時熒光定量 PCR 測量標(biāo)本的 ΔCt 值并進(jìn)行分析。結(jié)果 T 組 bcl-2 基因 ΔCt 值均小于 C 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＜0.05 )；bax 基因在 T 組術(shù)后 3 天、14 天和 28 天 ΔCt 值大于 C 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＜0.05 )，T 組 8 h、24 h 和 7 天三個時間點 ΔCt 值與 C 組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＞0.05 )；T 組 cytc 基因 ΔCt 值大于 C 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＜0.05 )；T 組 caspass-9 基因 ΔCt 值大于 C 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＜0.05 )。結(jié)論 甲強(qiáng)龍可以通過 bcl-2、cytc 及 caspass-9 的表達(dá)起到保護(hù)受傷節(jié)段脊髓的作用。

脊髓損傷；凋亡調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)類；功能恢復(fù)；甲基潑尼松龍

細(xì)胞凋亡是脊髓繼發(fā)性損傷的重要原因之一，bcl-2 及其基因家族是公認(rèn)的與細(xì)胞凋亡有關(guān)的基因。甲基潑尼松龍 ( methyprednisolone，MP ) 是目前臨床上使用的唯一經(jīng)過美國 FDA 認(rèn)證及推薦的用于治療急性脊髓損傷的藥物，研究[1]證實 MP 具有保護(hù)神經(jīng)功能可能是由于抑制了神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)了相應(yīng)的神經(jīng)功能，但其具體機(jī)制尚不清楚。本實驗觀察甲基潑尼松龍干預(yù)對急性期脊髓損傷后凋亡相關(guān)基因 bcl-2、bax、cytc 和 caspass-9 相對表達(dá)量的影響，進(jìn)一步探討該藥物促進(jìn)脊髓功能修復(fù)的機(jī)制，總結(jié)報告如下。

材料與方法

一、材料

1. 實驗動物：成年新西蘭大白兔 108 只，體重為 1.8～2.5 kg。

2. 試劑：液氮、氯仿、異丙醇、乙醇 ( DEPC水新鮮配制 )、DEPC 水、Trizol 試劑，由廣東賽哲生物科技有限公司提供；BiooPure，由美國 Bioo Scientific 公司提供；Fermentas EN0521、Fermentas K1622、Fermentas K0223，由 FERMENTAS 公司提供；微量 RNA 共沉淀劑，由上海泛柯生物技術(shù)有限公司提供；即用型熒光定量 PCR 試劑盒，由北京天恩澤基因科技有限公司提供。引物合成：由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成：Beta-actin 引物序列：上游：5’-GGCATCCTGACGCTCAAGTA-3’，下游序列：5’-TGGGTCTAGTACAAGCTCTGC-3’，擴(kuò)增片段長度為 192bP；bcl-2 引物序列：上游序列：5’-CTTCTTTGAGTTCGGTGGGGTC-3’，下游序列：5’-CGTACAGTTCCACGAAGGCATC-3’，擴(kuò)增片段長度為 161bP；bax 引物序列：上游序列：5’-GCTTCAGGGTTTCATCCAGG-3’，下游序列：5’-GTCCAGTTCGTCGCCAATG-3’，擴(kuò)增片段長度為 136bP；cytc 引物序列：上游序列：5’-GCCGCCCTATCGTGTTGTGTCA-3’，下游序列：5’-GCAGTTTAGCAGAGGGTGGGGT-3’，擴(kuò)增片段長度為 77bp；caspass-9 引物序列：上游序列：5’-TGAAGCCTGACCTGACCGCCAA-3’，下游序列：5’-TGACAACCACGCAGCAGTCCAG-3’，擴(kuò)增片段長度為 93bp。

二、方法

1. 分組、模型建立：將實驗動物隨機(jī)分為3 組：假手術(shù)組 ( S 組 ) 36 只，僅手術(shù)打開 T8～10段椎管，不損傷脊髓組織；單純損傷組 ( C 組 ) 36 只，手術(shù)打開 T8～10段椎管，改良 Allen’s 法對脊髓組織造成損傷后不予藥物治療；MP 治療組 ( T 組 ) 36 只，手術(shù)打開椎管，改良 Allen’s 法對脊髓組織造成損傷，立即按 30 mg / kg 靜脈注射 MP 治療，傷后 1 h 即開始按 5.4 mg / kg 的總量分 4 次靜脈注射[2]。術(shù)后實驗動物分籠喂養(yǎng)，定期按摩膀胱，所有實驗動物肌肉注射青霉素 80 萬單位預(yù)防感染，連續(xù) 3 天。實驗中若出現(xiàn)死亡及淘汰的動物及時補充。

2. 脊髓 RNA 標(biāo)本提?。焊鹘M動物分別于術(shù)后8 h、24 h、3 天、7 天、14 天和 28 天處死，取脊髓，置于用液氮預(yù)冷的研缽中迅速研磨成粉末，每50～100 mg 組織加入 0.5 ml BiooPure。加入 100 μl體積的氯仿 ( 為 BiooPure 總體積的 1 / 5 )，室溫下靜置 5 min，12 000 rpm 4 ℃ 離心 15 min，吸取上清加1 μl RNA 共沉淀劑，再加入等量的異丙醇 250 μl 室溫靜置 10 min，12 000 rpm 4 ℃ 離心 10 min，棄上清。加 1 ml 70% 乙醇，7500 rpm 4 ℃ 離心 5 min。待 RNA 略干后，加 10 μl DEPC 水溶解。分光光度計檢測 RNA 濃度。

3. RNA 純化：取 0.2 ml PCR 管，并依次加入1 μg RNA、1 μl 氯化鎂反應(yīng)緩沖液、1 μl DNA 酶I 依次按量加入，最后添加經(jīng) DPEC 處理過的蒸餾水使總體積至 10 μl，然后放置在 37 ℃ 溫箱內(nèi)孵育30 min，后加入 1 μl 50 mmol / L EDTA ，在 65 ℃ 溫箱內(nèi)孵育 10 min。

4. 反轉(zhuǎn)錄：取 0.2 ml PCR 管，依次加入上述去除 DNA 的 1 μg 總 RNA，并加入 1 μl 六聚體引物后加入蒸餾水至 12 μl 放入 65 ℃ 溫箱內(nèi)恒溫處理5 min，以用來打開 RNA 的 G-C 富集區(qū)。將樣品于冰上冷卻后加入 4 μl 反應(yīng)緩沖液、1 μl RNA 酶抑制劑 ( 由 RiboLock 公司生產(chǎn) )、1 μl 逆轉(zhuǎn)錄酶 ( 由RevertAid 公司生產(chǎn) ) 和 2 μl 10 mmol / L dNTP 混合液放置于 25 ℃ 溫箱內(nèi)撫育 5 min，然后于 42 ℃ 溫箱內(nèi)中孵育 60 min，最后將上述樣品置于 70 ℃ 溫箱內(nèi)處理 5 min 滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，進(jìn)行 RT-PCR 反應(yīng)。

5. 熒光定量 PCR 反應(yīng)：采用熒光定量 PCR 試劑盒，加入 1 μl Beta-actin 引物、1 μl bcl-2 / bax / cytc / caspass-9 引物、1 μl cDNA，最后加入蒸餾水 9.5 μl，從而保證總體積為 25 μl，然后進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。其中，起始溫度為 95 ℃，持續(xù) 10 min，循環(huán) 1 次；變性溫度 95 ℃，持續(xù) 15 s，退火溫度因各種引物的不同有所差異，bcl-2、bax 為 61 ℃，cytc、caspass-9退火溫度為 62 ℃，持續(xù) 1 min，循環(huán) 40 次；然后進(jìn)行解離程序，分別在 95 ℃ 持續(xù) 15 s，60 ℃ 持續(xù)1 min，95 ℃ 持續(xù) 15 s，循環(huán) 1 次。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS 13.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計數(shù)據(jù)處理，對實驗中所得到的 Ct 值，采用 beta-actin 校訂后，得到 ΔCt 值進(jìn)行析因設(shè)計方差分析和 SNK 法進(jìn)行多個樣本均數(shù)間的多重比較。以 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各時間點 bcl-2 表達(dá)量差異

對照組各個時間點的 ΔCt 值平均值 ( 8.43 ) 大于空白組各個時間點 ΔCt 值的平均值 ( 8.33 ) 并大于實驗組各個時間點 ΔCt 值平均值 ( 7.58 )，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＜0.05 )，從圖1C 可以看出：在對照組，尤其在 8 h、7 天、14 天和 28 天，ΔCt 值低；在 24 h和 3 天組，ΔCt 值高；實驗組在各個時間段 ΔCt 值均低于對照組；而實驗組在 24 h、7 天和 28 天三個時間點 ΔCt 值較同組其他時間點低。由上述結(jié)果可以得出結(jié)論：( 1 ) 對于未經(jīng) MP 治療的急性脊髓損傷動物，在傷后 24 h 和 3 天時間點，bcl-2 表達(dá)量下降，而在 8 h、7 天、14 天和 28 天時間點 bcl-2 表達(dá)量增高；( 2 ) 采用 MP 治療組相比對照組 bcl-2 表達(dá)量增高，而且在 24 h 和 7 天兩個時間點與對照組差距較大。

圖1 A：bcl-2 擴(kuò)增曲線；B：bcl-2 標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線的方程為 Y = ( -3.575 ) X + 28.661，擴(kuò)增效率為 90.41%；C：為空白組、對照組和實驗組在不用的時間點 bcl-2 基因表達(dá) ΔCt 值均值，結(jié)果顯示實驗組 ΔCt 值均小于對照組 ( P＜0.05 )Fig.1 A: The amplification curve of the gene bcl-2; B: The standard curve of the bcl-2, and the equation is Y=( -3.278 )X+28.714. The amplification effency is 101.85%; C: The curve of the means of ΔCt of gene bcl-2. Gene bcl-2 in group C is more higher than group T ( P＜0.05 )

二、各時間點 bax 表達(dá)量差異

空白組各個時間點 ΔCt 值的平均值 ( 7.46 ) 大于實驗組各個時間點 ΔCt 值平均值 ( 6.84 ) 并大于對照組各個時間點的 ΔCt 值平均值 ( 6.38 )，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＜0.05 )。從圖2C 中可以看出雖然實驗組各個時間點 ΔCt 值均大于同時間點對照組 ΔCt值，但從整體上看，兩條曲線相差不大，尤其是在24 h、3 天和 7 天三個時間點。因此考慮極有可能MP 治療急性脊髓損傷主要使 bcl-2 表達(dá)提高，從而間接提高 bcl-2 / bax 形成異源二聚體的比例來起到抗細(xì)胞凋亡的作用。

三、各時間點 cytc 表達(dá)量差異

空白組各個時間點 ΔCt 值的平均值 ( 8.32 ) 大于實驗組各個時間點 ΔCt 值平均值 ( 6.13 ) 并大于對照組各個時間點的 ΔCt 值平均值 ( 3.11 )，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＜0.05 )。從圖3C 中可以看出實驗組各個時間點 cytc ΔCt 值均大于同時間點對照組 cytc ΔCt 值且差距較大，且在 24 h、3 天、7 天實驗組與對照組差距較大，在 3 天時間點實驗組 cytc ΔCt 值達(dá)到最大。表明 MP 可以使得脊髓損傷動物受傷脊髓節(jié)段cytc 表達(dá)減低。

四、各時間點 caspass-9 表達(dá)量差異

空白組各個時間點 ΔCt 值的平均值 ( 9.57 ) 大于實驗組各個時間點 ΔCt 值平均值 ( 8.05 ) 并大于對照組各個時間點的 ΔCt 值平均值 ( 5.51 )，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＜0.05 )。從圖4C 中可以看出各個時間點 caspass-9 ΔCt 值均大于同時間點對照組 caspass-9 ΔCt 值，且差距較大，而在 7 天時間點實驗組與對照組差距最大，由上圖可以看出，MP 可以使得脊髓損傷動物受傷脊髓節(jié)段 caspass-9 表達(dá)減低。

圖4 A：caspass-9 的擴(kuò)增曲線；B：caspass-9 標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線的方程為 Y = ( -2.989 ) X + 34.189，擴(kuò)增效率為 105.04%；C：為空白組、對照組和實驗組在不用的時間點 caspass-9 基因表達(dá) ΔCt 值均值，實驗組 ΔCt 值均小于對照組 ( P＜0.05 )Fig.4 A: The amplification curve of the caspass-9; B: The standard curve of caspass-9, and the equation is Y = ( -3.545 ) X + 29.345. The amplification effency is 91.46%; C: curve of the means of ΔCt of caspass-9. There are more caspass-9 in group C than that in group T ( P＜0.05 )

討 論

MP 是目前臨床上使用的唯一經(jīng)過美國 FDA 認(rèn)證及推薦的用于急性脊髓損傷的藥物。大量研究認(rèn)為 MP 的神經(jīng)保護(hù)作用包括[3-4]：改善受傷局部微循環(huán)；抑制脂質(zhì)過氧化；減少細(xì)胞鈣內(nèi)流；維持神經(jīng)元興奮性等。隨著近年來對 MP 治療急性脊髓損傷的研究不斷加深，認(rèn)為 MP 具有保護(hù)神經(jīng)功能可能是由于抑制了神經(jīng)細(xì)胞凋亡[5]，從而保護(hù)了相應(yīng)的神經(jīng)功能。

細(xì)胞凋亡是一個涉及凋亡基因表達(dá)及相關(guān)蛋白質(zhì)合成的過程。在目前研究與凋亡有關(guān)的基因中，bcl-2 及其基因家族是被公認(rèn)的與細(xì)胞凋亡有關(guān)的基因的一種，而在 bcl-2 基因家族中，bcl-2 和 bax是目前被研究最多的兩個基因，二者分別為抑制凋亡基因和促進(jìn)凋亡基因。Kotipatruni[6]在實驗中發(fā)現(xiàn)在大鼠中重度脊髓損傷的相應(yīng)脊髓節(jié)段 bcl-2 免疫呈陽性反應(yīng)；Vaquero[7]通過 bcl-2 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入腺病毒并注射至實驗大鼠相應(yīng)受傷脊髓節(jié)段內(nèi)，發(fā)現(xiàn)bcl-2 具有保護(hù)脊髓的作用。Men 等[8]通過實驗證明bcl-2 起到抗細(xì)胞凋亡的作用往往要以形成異源二聚體的形式。Tsujimoto[9]認(rèn)為當(dāng) bcl-2 / bax 形成的異源二聚體的表達(dá)比例高于同源二聚體時，即高于bax / bax 及 bcl-2 / bcl-2 時起到抗細(xì)胞凋亡作用。因此，異源二聚體的形成比例是決定細(xì)胞是否抑制凋亡的關(guān)鍵因素。本實驗中設(shè)計的 bax 引物制作其擴(kuò)增曲線，并未見形成雙峰現(xiàn)象，表明引物并未形成二聚體，MP 治療急性脊髓損傷主要使 bcl-2 表達(dá)提高，從而間接提高 bcl-2 / bax 形成異源二聚體的比例來起到抗細(xì)胞凋亡的作用。

bcl-2 特定的 BH3 域蛋白與促凋亡蛋白結(jié)合，通過直接與 bax 和 bak 結(jié)合觸發(fā)凋亡；抗凋亡的bcl-2 家族成員隔離了 BH3 域蛋白，阻斷了 bax 和bak 促凋亡；促凋亡成員 bax 和 bak 通過與一種或兩種抗凋亡 bcl-2 蛋白結(jié)合而處于一種無效的構(gòu)象狀態(tài)。Shimizu[10]認(rèn)為線粒體中的 bcl-2 可以通過與bax 結(jié)合形成二聚體導(dǎo)致 bax 功能失活，從而抵消bax 的所有功能。本實驗對 bax 的檢測顯示，急性脊髓損傷后實驗動物的 bax 基因表達(dá)量升高，MP 的沖擊治療可以使 bax 表達(dá)量下降；而作為促凋亡因子bax 的降低，能明顯提高 bcl-2 / bax 的比值。這一現(xiàn)象說明，MP 沖擊療法可以有效的提高脊髓局部節(jié)段bcl-2 表達(dá)量、降低 bax 表達(dá)量，抑制細(xì)胞凋亡。

越來越多的研究表明，細(xì)胞色素 C 在細(xì)胞凋亡中起到重要作用，細(xì)胞色素 C 的釋放與重新定位，其本身可以激活 Apas-1 和 caspase-9 的前體[10]，從而激活 caspase 途徑引起細(xì)胞凋亡，當(dāng)出現(xiàn)大量抑制性物質(zhì)時，特別是內(nèi)源性抑制物如 bcl-2 等，由于其在呼吸鏈中作用重要，通過細(xì)胞色素 C 這一路徑引起的凋亡便會終止，因此，線粒體中細(xì)胞色素 C 的缺失導(dǎo)致呼吸鏈?zhǔn)芤种?，進(jìn)而引起細(xì)胞壞死。bcl-2 可抑制線粒體釋放細(xì)胞色素 C，從而抑制caspase 途徑激活的細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

本實驗采用熒光定量 PCR 的方法，對 bcl-2、bax、cytc 和 caspass-9 進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)采用 MP 治療組相比對照組 bcl-2 表達(dá)量增高，bax 表達(dá)量降低，cytc 及 caspass-9 表達(dá)量降低，且 cytc 及 caspass-9兩者有呈正相關(guān)性。線粒體途徑是通過 bcl-2 家族中促凋亡基因激活 cytc 進(jìn)而激活 caspass-9 從而完成細(xì)胞凋亡的途徑，猜測 MP 通過提高 bcl-2 表達(dá)，降低 cytc 的表達(dá)，從而抑制 caspass-9 的表達(dá)，這一路徑受到阻滯，從而起到抗細(xì)胞凋亡的作用。因PCR 技術(shù)本身的限制，并不能對其轉(zhuǎn)錄翻譯的產(chǎn)物進(jìn)行分析，因此還需要下一步通過蛋白印記等技術(shù)對其轉(zhuǎn)錄翻譯的產(chǎn)物進(jìn)一步研究，對此機(jī)制進(jìn)一步證實。

[1] 鄭力恒, 林宏生, 李錦聰, 等. 脊髓損傷后急性期甲基潑尼松龍干預(yù)對脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響. 中國脊柱脊髓雜志, 2012, 22(5):452-458.

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( 本文編輯：馬超 )

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Effects of methylprednisolone on the neurocyte apoptotic genes such as bcl-2 following acute spinal cord injury

ZHENG Li-heng, LIN Hong-sheng, ZHANG Guo-wei, LI Jing-cong, XIE Lin, ZHANG Da-wei. Centro Hospitalar Conde de Sào Januário, Macau, 999078, PRC

ObjectivesTo observe the effects of methylprednisolone ( MP ) on the neurocyte apoptotic genes such as bcl-2, bax, cytc caspass-9 following acute spinal cord injury ( SCI ) and investigate the mechanisms of spinal cord recovery.MethodsAll experimental rabbits were divided randomly into 3 groups: sham group ( group S, 36 rabbits ), control group ( group C, 36 rabbits ) and MP treatment group ( group T, 36 rabbits ). The spinal cord injury models were made according to Allen’s weight-drop method. 6 rabbits were selected randomly and sacrifced at 8 h, 24 h, 3 d, 7 d, 14 d and 28 d after the injury. The RTFQ- PCR test were taken according to their injured spinal sections, and the results of ΔCt were compared and analyzed.ResultsThe results of ΔCt of gene bcl-2 in group T was lower than in group C, which is statistically signifcant ( P＜0.05 ). At 3 d, 14 d and 28 d after the injury, the results of ΔCt of gene bax was higher in group C than in group T, which is statistically signifcant ( P＜0.05 ). No signifcant differences were found between group C and T at 8 h, 24 h and 28 d ( P＞0.05 ). Group T had better expressions in the ΔCt of gene cytc and caspass-9 than group C at all time points, which is statistically signifcant ( P＜0.05 ).ConclusionsMP plays a protective role in treating the acute spinal cord injury by affecting the expressions of the bcl-2, cytc and caspass-9 gene.

Spinal cord injuries; Apoptosis regulatory proteins; Recovery of function; Methyprednisolone

10.3969/j.issn.2095-252X.2014.01.012

R683.2

澳門科學(xué)技術(shù)發(fā)展基金 ( 026/2010/A )；廣東省科技計劃項目 ( 2010-170-1 )

999078 澳門，澳門仁伯爵綜合醫(yī)院 ( 鄭力恒，謝林 )；澳門醫(yī)學(xué)科技研究協(xié)會 ( 鄭力恒，李錦聰，謝林 )；510632 廣州，暨南大學(xué)骨科疾病研究所 ( 鄭力恒，林宏生，張國威，張大衛(wèi) )；暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨一區(qū) ( 林宏生，張國威，張大衛(wèi) )

林宏生，Email: tlinhs@jnu.edu.cn

2013-05-09 )