施 維，許 波，金仁桃，吳麗敏，周桂香，劉雨生，童先宏

暗色透明帶卵母細(xì)胞臨床結(jié)局及超微結(jié)構(gòu)分析

施 維，許 波，金仁桃，吳麗敏，周桂香，劉雨生，童先宏

目的對(duì)暗色透明帶（ZP）卵母細(xì)胞在體外受精胚胎移植中，胚胎發(fā)育潛能及受精率、種植率、臨床妊娠率及超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。方法根據(jù)光鏡下ZP的折光性，將33例患者卵母細(xì)胞全部為暗色ZP的納入研究組，將108例患者卵母細(xì)胞全部為正常ZP的納入對(duì)照組。對(duì)兩組患者的年齡、不孕年限、基礎(chǔ)卵泡刺激素值（FSH）、促性腺激素（Gn）總量、人絨毛促性腺激素（HCG）注射日內(nèi)膜厚度、HCG注射日雌二醇（E2）值、獲卵數(shù)、成熟卵率、受精率、種植率、臨床妊娠率和流產(chǎn)率進(jìn)行比較分析。并對(duì)暗色ZP的卵母細(xì)胞和正常卵母細(xì)胞在透射電子顯微鏡下觀察的卵母細(xì)胞ZP、卵母細(xì)胞卵周隙、卵母細(xì)胞細(xì)胞器等超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果兩組患者年齡、不孕年限、基礎(chǔ)FSH、Gn總量、HCG注射日內(nèi)膜厚度、HCG注射日E2值、獲卵數(shù)、成熟卵率、卵裂率和流產(chǎn)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而研究組的受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、臨床妊娠率較對(duì)照組均顯著下降（P＜0.05）。對(duì)研究組的超微結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，暗色ZP卵母細(xì)胞ZP內(nèi)高電子致密物明顯增多，同時(shí)卵母細(xì)胞胞質(zhì)中異常線粒體和液泡明顯增多。結(jié)論暗色ZP卵母細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變?nèi)绨|(zhì)內(nèi)異常線粒體及液泡增多，從而導(dǎo)致卵母細(xì)胞質(zhì)量下降、胚胎發(fā)育潛能和臨床妊娠結(jié)局降低。

透明帶；卵母細(xì)胞；胚胎發(fā)育；透射電鏡；線粒體

受精是一個(gè)精卵相互作用極其精細(xì)而又協(xié)調(diào)發(fā)育的復(fù)雜過(guò)程，而人類卵子受精過(guò)程中透明帶（zona pellucid，ZP）起著不可替代的作用。暗色ZP屬于胞質(zhì)外異常［1－2］，曾有多個(gè)中心對(duì)暗色ZP進(jìn)行了報(bào)道和相關(guān)分析，根據(jù)筆者中心臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)暗色ZP的卵母細(xì)胞在接受體外受精胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）的患者中總體發(fā)生率約為5%，筆者發(fā)現(xiàn)在一次超排卵過(guò)程中卵母細(xì)胞全部為暗色ZP的周期中受精率和胚胎發(fā)育潛能低下。因此，該研究對(duì)1次周期中出現(xiàn)全部為暗色ZP的卵母細(xì)胞進(jìn)行回顧性分析及超微結(jié)構(gòu)研究，探討其是否影響妊娠結(jié)局和胚胎發(fā)育潛能。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象收集我院2010年11月～2012年6月共141例接受IVF或卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射技術(shù)（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）治療的不孕癥患者，其中1次促排周期中全部卵母細(xì)胞為暗色ZP的患者33例（19例IVF，14例ICSI周期）為研究組，全部卵母細(xì)胞為正常ZP的患者108例（64例IVF，44例ICSI周期）為對(duì)照組。兩組患者的年齡均≤36歲，不孕原因均為輸卵管因素、男方因素（弱精子癥、梗阻性無(wú)精子癥等）等，并排除染色體異常、卵巢低反應(yīng)等疾病。收集IVF-ET周期新鮮廢棄卵母細(xì)胞（常規(guī)IVF 42～48h后未分裂的成熟受精卵母細(xì)胞）共23枚，其中暗色ZP的卵細(xì)胞11枚，正常ZP卵母細(xì)胞12枚，制作成電鏡標(biāo)本觀察。所有用于研究的卵母細(xì)胞均經(jīng)患者同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 促排卵方法 患者均為標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)方案：從月經(jīng)的黃體中期開(kāi)始使用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（gonadotropin releasinghormone agonist，GnRHa）皮下注射，降調(diào)節(jié)14 d后，超聲檢查子宮內(nèi)膜厚度，竇卵泡數(shù)量和大?。淮迓雅荽碳に刂担╢olliclestimulatinghormone，F(xiàn)SH）、黃體生成素（luteinizinghormone，LH）、雌二醇（Estradiol，E2）達(dá)到降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)后，則開(kāi)始使用FSH和（或）尿促性腺激素（human menopausal gonadotropin，HMG）超排卵治療。用陰道B超每天監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育情況，當(dāng)B超顯示2個(gè)卵泡＞18 mm或3個(gè)卵泡＞17 mm時(shí)，當(dāng)天肌注人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，HCG）10 000 IU，34～36h后取卵。取卵后常規(guī)短時(shí)受精或ICSI培養(yǎng)［3］。

1.2.2 IVF-ET及妊娠結(jié)局判斷 卵母細(xì)胞取出體外后，精液處理采用上游法或密度梯度離心法。卵丘復(fù)合體培養(yǎng)4h后，根據(jù)男方精液常規(guī)指標(biāo)分析指標(biāo)采用不同的授精方式［4］，即（a＋b）級(jí)精子總數(shù)≥10×106的采用IVF，另外（a＋b）級(jí)精子總數(shù)＜10 ×106的采用ICSI。授精后16～18h觀察原核情況，授精42h后觀察卵裂情況，根據(jù)卵裂球大小均勻與否及碎片占整個(gè)胚胎的比例進(jìn)行胚胎質(zhì)量評(píng)分，將胚胎分為4級(jí)，Ⅰ級(jí)：卵裂球大小均勻，無(wú)碎片；Ⅱ級(jí)：卵裂球大小均勻，碎片＜20%；Ⅲ級(jí)卵裂球大小不均勻，碎片＜20%；Ⅳ級(jí)：卵裂球大小均勻或不均勻，碎片20%～50%。Ⅰ～Ⅱ級(jí)胚胎視為優(yōu)質(zhì)胚胎，根據(jù)患者情況將2～3個(gè)形態(tài)學(xué)評(píng)分最佳的胚胎在超聲指導(dǎo)下移植入子宮，剩余有發(fā)育潛能的胚胎行冷凍保存。胚胎移植后第2天開(kāi)始行黃體支持治療。胚胎移植14 d后檢查血清絨毛膜促性腺激素（β-HCG），陽(yáng)性者繼續(xù)進(jìn)行黃體支持，胚胎移植4周后B超檢查見(jiàn)孕囊及胚芽診斷為臨床妊娠，否則為生化妊娠。

1.2.3 光鏡下觀察ZP 將顆粒細(xì)胞去除干凈在光鏡下觀察卵母細(xì)胞ZP情況，1個(gè)超排周期中全部為暗色ZP的為研究組，正常ZP為對(duì)照組。在ICSI周期中，將顆粒細(xì)細(xì)胞包裹的卵母細(xì)胞放入FALCON 3001皿中，用40 IU透明質(zhì)酸酶消化，在用手工拉細(xì)的玻璃針吹吸去除多余的放射冠細(xì)胞和血細(xì)胞，徹底將放射冠細(xì)胞和卵母細(xì)胞分離。在IVF周期中，將受精后16～18h的卵丘復(fù)合物用手工拉細(xì)的玻璃針小心吹吸多次，分離放射冠細(xì)胞和卵母細(xì)胞。將分離后的卵母細(xì)胞在奧林巴斯倒置顯微鏡下放大400倍觀察ZP情況。

1.2.4 IVF相關(guān)結(jié)局指標(biāo)計(jì)算方法 ICSI周期中成熟卵率＝成熟卵數(shù)/獲卵數(shù)；IVF受精率＝受精卵數(shù)/獲得卵數(shù)×100%；ICSI受精率＝受精卵數(shù)/成熟卵數(shù)×100%；卵裂率＝卵裂卵數(shù)/受精卵數(shù)× 100%；優(yōu)質(zhì)胚胎率＝（Ⅰ級(jí)胚胎數(shù)＋Ⅱ級(jí)胚胎數(shù)）/總胚胎數(shù)×100%；胚胎種植率＝妊娠囊數(shù)/移植胚胎個(gè)數(shù)；臨床妊娠率＝臨床妊娠數(shù)/移植周期數(shù)× 100%；流產(chǎn)率＝流產(chǎn)數(shù)/臨床妊娠數(shù)×100%。

1.2.5 透射電鏡（transmission electron microscopy，TEM）下觀察卵母細(xì)胞 將標(biāo)本迅速固定于4℃、25 g/L的戊二醛，固定4～6h后將卵母細(xì)胞從戊二醛中取出，用pH 7.2的PBS液沖洗干凈，固定于1%鋨酸1.0～1.5h，然后用梯度乙醇脫水，脫水后吸去乙醇，加入環(huán)氧丙烷透明30 min，然后換成環(huán)氧丙烷與Epon812環(huán)氧樹(shù)脂（1∶1）配制的混合液浸透1.5h，用圓錐底的塑料包埋模，最后用Epon812環(huán)氧樹(shù)脂加滿進(jìn)行包埋，投入65℃烤箱中48h，降至室溫。取出包埋好的組織以60～80 nm厚度進(jìn)行超薄切片（超薄切片機(jī)型號(hào)LKB-NOVA型，瑞典產(chǎn)）。將干燥好的帶樣品的銅網(wǎng)放入醋酸雙氧鈾液滴中染色30 min，用雙蒸水沖洗，再放入檸檬酸鉛液滴中染色10 min，雙蒸水沖洗后干燥，制備好的電鏡樣品JEM-1230型TEM觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，兩組獨(dú)立樣本比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下觀察暗色ZP卵母細(xì)胞與正常ZP卵母細(xì)胞兩組的卵母細(xì)胞在光鏡下的形態(tài)如圖1所示，研究組為暗色ZP的卵母細(xì)胞，對(duì)照組為正常ZP的卵母細(xì)胞在光鏡下顯示出折光率不同。

圖1 光鏡下的暗色ZP卵母細(xì)胞與正常ZP卵母細(xì)胞 ×400

2.2 兩組患者一般情況及超排卵觀察指標(biāo)及臨床結(jié)局比較兩組患者的年齡、不孕年限、基礎(chǔ)FSH、促性腺激素（Gn）總量、注射HCG日內(nèi)膜厚度及E2值和獲卵數(shù)相比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。兩組在ICSI周期中成熟卵率、卵裂率間和流產(chǎn)率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而研究組雙原核（two pronuclei，2PN）受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、胚胎種植率和臨床妊娠率均明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.3 TEM下暗色ZP卵母細(xì)胞與正常ZP卵母細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)

表1 一般臨床資料及基本特征比較（±s）

表1 一般臨床資料及基本特征比較（±s）

項(xiàng)目研究組（n＝33）對(duì)照組（n＝108）t值P值年齡（歲）31.26±4.2330.56±4.390.580.56不孕年限（年）5.13±2.854.88±3.050.440.66基礎(chǔ)FSH（U/L）7.70±2.557.35±2.640.650.52 Gn總量（IU）2 496.63±755.862 407.53±867.140.520.61 HCG日內(nèi)膜厚度（mm）11.21±2.3511.13±2.140.640.52 HCG日E2（ng/L）2 772.33±1 302.112 912.18±1 384.940.800.43獲卵數(shù)（個(gè)）10.18±5.1110.73±4.760.660.51

表2 IVF結(jié)局相關(guān)指標(biāo)比較（%）

2.3.1 對(duì)照組 ZP為正常的網(wǎng)狀疏松狀結(jié)構(gòu)，厚10～14 nm，含有大量卵泡細(xì)胞胞膜殘留物，內(nèi)可見(jiàn)散在排列的纖維物，纖維呈直線型或彎曲型，長(zhǎng)0.1～0.4 μm，見(jiàn)圖2A、C。對(duì)照組在卵膜和ZP之間為卵周隙，呈一狹窄透亮間隙，內(nèi)可見(jiàn)第一極體、呈樹(shù)突狀粗大的微絨毛，見(jiàn)圖3C。卵膜下可見(jiàn)一層散在線性排列的皮質(zhì)顆粒（cortical granule，CG），見(jiàn)圖3A。胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富，可見(jiàn)高爾基體及周圍的分泌小泡、光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（smooth endoplasmic reticulum，SER）、SER集合管、SER大泡及小泡、線粒體等，其中線粒體又是最主要的細(xì)胞器。線粒體大多呈橢圓形，中度密集，有少量嵴，結(jié)構(gòu)清晰；有些線粒體較平，呈新月型圍繞在SER小泡周圍；有些線粒體成簇，圍繞于整齊的SER嵴周圍，線粒體與SER小管及小泡一起，形成體積較大線粒體SER－線粒體復(fù)合物，見(jiàn)圖4A。

2.3.2 研究組 ZP呈網(wǎng)狀疏松結(jié)構(gòu)，但可見(jiàn)高電子密度的致密纖維組織，明顯比正常ZP增多，見(jiàn)圖2B、D。卵周隙正常同對(duì)照組，可見(jiàn)第一極體及豐富的微絨毛等，見(jiàn)圖3D。卵膜下均可見(jiàn)散在分布的皮質(zhì)顆粒，見(jiàn)圖3B。胞質(zhì)中可見(jiàn)大量細(xì)胞器，高爾基體、SER、SER集合管等與對(duì)照組相比未見(jiàn)異常。但胞質(zhì)內(nèi)主要的細(xì)胞器為線粒體，其數(shù)量略減少，有的孤立存在，未與SER泡相連；線粒體結(jié)構(gòu)也存在異常，如嵴結(jié)構(gòu)消失或減少、形態(tài)幼稚化、內(nèi)膜結(jié)構(gòu)丟失、線粒體內(nèi)可見(jiàn)空泡及膨大等，見(jiàn)圖4B、C。SER－線粒體復(fù)合物中也可見(jiàn)大量結(jié)構(gòu)異常的線粒體及線粒體空泡復(fù)合物。胞質(zhì)中還含大量SER液泡，打斷正常胞質(zhì)間連接，見(jiàn)圖4D。

圖2 暗色ZP與正常ZP在TEM下的結(jié)構(gòu)

圖3 TEM下兩組卵母細(xì)胞胞質(zhì)與卵周隙的超微結(jié)構(gòu)

3 討論

目前在IVF實(shí)驗(yàn)室工作中評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞及胚胎質(zhì)量仍多采用形態(tài)學(xué)評(píng)分法，其沒(méi)有損害其生物活性及發(fā)育潛能，故很適用于輔助生殖等生物技術(shù)領(lǐng)域，ZP也是評(píng)價(jià)胚胎和卵母細(xì)胞質(zhì)量和發(fā)育潛能的指標(biāo)之一。已有研究［1，5］報(bào)道，ZP異常均可以影響受精、胚胎發(fā)育潛能和種植率。Nottola用相差顯微鏡觀察顏色發(fā)暗的囊胚，發(fā)現(xiàn)其ZP外型不規(guī)則、結(jié)構(gòu)斷裂，發(fā)育潛能低下［6］；相反有學(xué)者認(rèn)為暗色ZP和正常卵母細(xì)胞相比有著同樣的受精率和胚胎發(fā)育潛能，可以成功懷孕［1，7］。本研究顯示，雖然移植了暗色ZP的胚胎的患者可以成功懷孕，但臨床妊娠率顯著降低。因此筆者推測(cè)暗色ZP卵母細(xì)胞的卵母細(xì)胞質(zhì)量和胚胎發(fā)育的潛能降低。

圖4 TEM下兩組的卵母細(xì)胞胞質(zhì)與線粒體的超微結(jié)構(gòu)

目前，TEM可作為評(píng)價(jià)卵子及胚胎質(zhì)量的最有價(jià)值的客觀評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。本研究發(fā)現(xiàn)暗色ZP卵子的ZP內(nèi)高電子致密物及纖維物明顯增多，這有可能是ZP在光鏡下折射改變的原因之一。ZP是由初級(jí)卵母細(xì)胞分泌而形成的酸性糖蛋白膜，在誘導(dǎo)精卵識(shí)別和結(jié)合，激活精子發(fā)生頂體反應(yīng)，受精后阻止多精入卵中起著重要的作用［8］。任何ZP結(jié)構(gòu)、蛋白成分發(fā)生異常都會(huì)影響精、卵正常結(jié)合，導(dǎo)致受精失敗，而且ZP蛋白質(zhì)表達(dá)減少或者修飾異常可能直接反應(yīng)出卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中存在的不足［9］，同時(shí)也表明顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞胞質(zhì)之間正常的信號(hào)通信和連接可能受到了干擾。本研究發(fā)現(xiàn)暗色ZP的卵子在IVF和ICSI周期中的受精率均明顯降低，表明暗色ZP并不是通過(guò)阻止精卵結(jié)合來(lái)影響正常的受精過(guò)程，而是表明這些暗色ZP的卵子可能成熟程度不足，并且與周圍顆粒細(xì)胞的通訊存在障礙。

其次，本研究用TEM觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)，暗色ZP的卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)嚴(yán)重畸形，線粒體空泡、膨大、內(nèi)膜結(jié)構(gòu)丟失等。線粒體作為卵母細(xì)胞內(nèi)最主要的細(xì)胞器，產(chǎn)生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），是細(xì)胞的主要能量供應(yīng)者，對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育潛能起著決定性作用，與細(xì)胞的代謝水平、增殖和分化密切相關(guān)［10－11］。線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變可以直接影響代謝活動(dòng)，從而降低卵母細(xì)胞的質(zhì)量和胚胎發(fā)育潛能［12］。異常線粒體的數(shù)量在胞質(zhì)中明顯增多，可能影響了卵母細(xì)胞的正常能量代謝和提供，從而導(dǎo)致暗色ZP卵母細(xì)胞受精能力及優(yōu)質(zhì)胚胎率的下降。

暗色ZP卵母細(xì)胞的胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)有大量液泡結(jié)構(gòu)打斷了胞質(zhì)中正常連接。研究［13］顯示卵母細(xì)胞液泡的形成可能也標(biāo)志著其他胞質(zhì)超微結(jié)構(gòu)的改變，如受損的線粒體的存在、卵黃膜斷裂等卵母細(xì)胞凋亡、衰老方面的表現(xiàn)。Coticchio et al［14］指出在發(fā)育成熟卵母細(xì)胞中很少出現(xiàn)，這些液泡可能被認(rèn)為是胞質(zhì)不成熟的一個(gè)標(biāo)志。

研究組中IVF和ICSI受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率和臨床妊娠率與對(duì)照組相比均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)TEM研究結(jié)果表明，這些卵子胞質(zhì)可能不成熟，胞質(zhì)與核發(fā)育不同步，影響了卵母細(xì)胞的正常發(fā)育，從而導(dǎo)致受精失敗，發(fā)育潛能低下。另外，研究組的卵母細(xì)胞可能存在著卵子本身質(zhì)量低下，影響了卵母細(xì)胞正常的生長(zhǎng)發(fā)育，致使優(yōu)質(zhì)胚胎率下降。即使種植了優(yōu)質(zhì)的胚胎由于胚胎內(nèi)部線粒體異常能量代謝不協(xié)調(diào)，胚胎發(fā)育異?；蜃铚鴮?dǎo)致種植率下降，臨床妊娠結(jié)局差的結(jié)果。

本研究即應(yīng)用TEM觀察暗色ZP卵母細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，結(jié)合線粒體及其他細(xì)胞器形態(tài)特征與功能的改變，分析卵母細(xì)胞受精失敗及胚胎發(fā)育阻滯的原因。發(fā)現(xiàn)其超微結(jié)構(gòu)的改變可能是造成其臨床妊娠結(jié)局下降的重要原因，所以暗色ZP可能提示了胚胎發(fā)育潛能較差，在選擇移植胚胎時(shí)應(yīng)避免選擇暗色ZP的胚胎。

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Analysis of the clinical outcome and ultrastructure of the oocytes with dark zona pellucida

Shi Wei，Xu Bo，Jin Rentao，et al
（Center for Reproductive Medicine，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

ObjectiveTo analyze the embryo developmental potential，fertilization rate，implantation rate，clinical pregnancy rate and ultrastructural of oocytes with dark zona pellucid（DZP）in vitro fertilization-embryo transfer.MethodsAccording to the different refraction of zona in microscope，the oocytes with DZP retrieved from 33 patients were collected as the study group，and 108 patients of whom oocytes with normal zona pellucida were received as controls.The age，duration of infertility，basic FSH，total of Gn doses，endometrial thickness on HCG day，E2 value on HCG day，number of oocytes，MII oocytes rate，fertilization rate，good embryos rate，implantation rate，clinical pregnancy rate and abortion rate were compared respectively between these two groups.The ultrastructure of oocytes with DZP and normal zona pellucida was detected using transmission electron microscope，including zona pellucida，perivitelline space，oocyte organelles.ResultsNo differences were detected in the age，duration of infertility，basic FSH，total of Gn doses，endometrial thickness on HCG day，E2 value on HCG Day，number of retrieving oocytes，rate of MII oocytes and abortion rate between them.The rate of fertilization in IVF and ICSI cycles，good embryos，implantation and clinical pregnancy in study group were significantly lower than that in control group.By ultrastructural analysis of using transmission electron microscopy（TEM），the appearance ofhigh electron dense in DZP，the number of abnormal mitochondria and vacuoles in the cytoplasm of oocytes with DZP increased significantly.ConclusionThe ultrastructural alterations such as abnormal mitochondria and intracytoplasmic vacuoles in oocytes with DZP，are resulting in reduced oocytes quality，embryo development potential and poor clinical pregnancy outcome.

zona pellucida；oocytes；embryo development；TEM；mitochondria

R 321-33

A

1000－1492（2014）04－0434－05

2013－10－16接收

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81373671）；安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：1308085QH131）；安徽省教育廳自然科學(xué)基金（編號(hào)：KJ2013Z134）

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，合肥 230001

施 維，女，碩士研究生；劉雨生，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：shizhizhongxin＠126.com；童先宏，男，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：tong68xianhong＠163.com