吳小琴綜述 李 俊審校

◇綜 述◇

人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因的表觀遺傳學(xué)調(diào)控

吳小琴1，2綜述 李 俊1，2審校

人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）是控制端粒酶活性的限制性成分。hTERT的表達受多種因素的調(diào)控，其中表觀遺傳學(xué)可通過DNA甲基化，組蛋白修飾及非編碼RNA調(diào)控hTERT基因的表達。有關(guān)hTERT基因表達的表觀遺傳學(xué)研究近幾年取得了較大進展。hTERT基因啟動子區(qū)甲基化的狀態(tài)、位點、作用及其臨床意義，非編碼RNA對hTERT基因的表達調(diào)控等已成為研究的熱點。本文就表觀遺傳學(xué)對hTERT基因表達的調(diào)控作一綜述。

端粒酶；人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶；表觀遺傳學(xué)；DNA甲基化；組蛋白修飾；非編碼RNA

端粒是真核細胞染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，可維持染色體的完整性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性等［1］。在正常細胞分裂過程中由于末端復(fù)制問題，端粒逐漸縮短，最終導(dǎo)致細胞衰老、死亡，而大多數(shù)腫瘤細胞則能通過端粒酶添加端粒重復(fù)序列TTAGGG至DNA末端，阻止端粒隨著細胞分裂而縮短，從而使細胞具有無限增殖的能力［2］。因此，端粒酶的活化是惡性腫瘤的普遍現(xiàn)象，在惡性腫瘤中其活性檢出率為85%～95%［3］。人的端粒酶主要由端粒酶RNA（human telomerase RNA，hTR）、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）和端粒相關(guān)蛋白（human telomerase-associated protein 1，hTP1）構(gòu)成。端粒酶依靠自身RNA模板，在hTERT催化下與hTP1作用合成端粒DNA。其中，hTERT的表達程度與端粒酶的活性密切相關(guān)，hTERT在單個體細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平為1～5拷貝，而在腫瘤細胞中基因拷貝數(shù)增加［4］。因此對hTERT表達的調(diào)控成為端粒酶研究的熱點。關(guān)于hTERT的調(diào)控有很多因素，比如各種小分子抑制劑、轉(zhuǎn)錄因子、hTERT磷酸化及顯性負性突變體等。

表觀遺傳學(xué)是指在不改變DNA序列的前提下使基因表達發(fā)生可遺傳性的變化，最終導(dǎo)致帶有相同DNA序列的各種細胞及組織具有不同的基因表達模式和生物學(xué)功能。表觀遺傳學(xué)調(diào)控主要有DNA甲基化、組蛋白修飾及非編碼RNA等，它們在人類各種疾病，尤其是腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。有研究［5］表明，表觀遺傳調(diào)控hTERT的活性。本文就關(guān)于hTERT基因表觀遺傳學(xué)調(diào)控的研究進展作一綜述。

1 DNA甲基化

1.1 hTERT基因結(jié)構(gòu)特點人類hTERT基因位于第5號染色體短臂5p15.33區(qū)，由16個外顯子和15個內(nèi)含子組成，總長約35 kbp。hTERT基因啟動子序列位于5’端一個5.8 kbp的基因片段中，轉(zhuǎn)錄起始點的上游181 bp區(qū)為核心啟動子，其序列上存在多個hTERT轉(zhuǎn)錄因子（Sp1、c-myc、Est、Mad-1等）的結(jié)合位點。hTERT基因的轉(zhuǎn)錄受控于其啟動子的調(diào)控。在hTERT基因啟動子區(qū)有一個富含GC區(qū)，構(gòu)成一個CpG島，分別定位于－208～－150 bp、－310～－20 bp、－330 bp至第2個外顯子之間、轉(zhuǎn)錄起始點上游181 bp或283 bp區(qū)域，長度59～290 bp不等，該島被認(rèn)為是DNA甲基化的一個靶點。

1.2 hTERT基因啟動子甲基化狀態(tài)及作用Nomoto et al［6］應(yīng)用PCR和單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)，對13株胃腸腫瘤細胞系、24例腸癌標(biāo)本及8例正常志愿者外周血細胞經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后分析，發(fā)現(xiàn)11種細胞系hTERT啟動子序列呈高甲基化的狀態(tài)；在腫瘤標(biāo)本中6例hTERT啟動子完全甲基化，17例呈部分甲基化，而正常組織多為非甲基化狀態(tài)。Cong et al［7］發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞中hTERT啟動子核心區(qū)（－500 bp）呈現(xiàn)高度甲基化狀態(tài)。以上研究表明hTERT啟動子處于高甲基化狀態(tài)，然而hTERT啟動子的這種甲基化狀態(tài)與其基因表達二者之間的關(guān)系尚不明確。多數(shù)研究表明DNA甲基化可以沉默基因表達，Liu et al［8－9］和Lopatina et al［10］證實hTERT啟動子甲基化可沉默hTERT基因表達。另外也有研究［11－12］表明二者之間并無顯著關(guān)系。然而越來越多研究表明在腫瘤細胞中hTERT調(diào)控區(qū)的甲基化狀態(tài)促進hTERT基因的表達。Guilleret et al［13］研究發(fā)現(xiàn)hTERT啟動子甲基化與hTERT表達呈正相關(guān)，并且端粒酶陽性細胞系用去甲基化試劑5-氮雜-2-脫氧胞苷（5-Aza-CdR）處理后hTERT表達下降，端粒酶活性降低及端?？s短。這種情況下CpG甲基化可能是通過干擾轉(zhuǎn)錄抑制因子的結(jié)合，從而正調(diào)控hTERT啟動子。造成以上這些不同的研究結(jié)果可能的原因是臨床標(biāo)本中有正常組織的存在或由不同的研究方法導(dǎo)致。De Wilde et al［14］對人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）誘導(dǎo)的致癌作用分析發(fā)現(xiàn)宮頸癌細胞株中hTERT啟動子甲基化程度與腫瘤表型的進展一致，但臨床樣本差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為hTERT啟動子的高甲基化通過與抑制性轉(zhuǎn)錄因子作用，進而影響hTERT基因的表達。Renaud et al［15］通過染色質(zhì)免疫沉淀實驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)hTERT基因的第一外顯子非甲基化時，與hTERT轉(zhuǎn)錄抑制因子CTCF結(jié)合并抑制hTERT的轉(zhuǎn)錄起始；而第一外顯子的調(diào)控序列發(fā)生甲基化時，CTCF不能與此結(jié)合位點結(jié)合，即解除CTCF對hTERT表達的抑制作用。從而推測hTERT啟動子CpG島甲基化的主要目的可能是為了阻斷CTCF的結(jié)合，從而促進hTERT的轉(zhuǎn)錄。Choi et al［16］應(yīng)用曲古柳菌素（Trichostatin A，TSA）下調(diào)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT1）誘導(dǎo)hTERT啟動子CpG島特定位點去甲基化，發(fā)現(xiàn)在這個去甲基化區(qū)域有CTCF的一個結(jié)合位點，位于CpG島的31st和33rd之間。當(dāng)TSA誘導(dǎo)CpG島特定位點的去甲基化時，促進了CTCF與hTERT啟動子上位點結(jié)合，從而抑制hTERT的轉(zhuǎn)錄。然而，研究表明hTERT啟動子完全甲基化明顯抑制hTERT轉(zhuǎn)錄，而啟動子局部的低甲基化對hTERT的表達起關(guān)鍵作用。Zinn et al［17］研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤細胞中盡管hTERT啟動子上游很多區(qū)域高度甲基化，但轉(zhuǎn)錄起始位點附件區(qū)域（－150～150 bp）的DNA低甲基化甚至非甲基化。如上所述，hTERT啟動子甲基化作用與一般慣例不同。然而，對于啟動子的高甲基化狀態(tài)及部分區(qū)域低甲基化與hTERT表達的具體關(guān)系仍待深入研究。

2 組蛋白修飾

2.1 組蛋白乙酰化組蛋白的乙?；腿ヒ阴；且粋€可逆的動態(tài)過程，主要發(fā)生在組蛋白分子N端賴氨酸殘基上，由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetylase，HAT）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）調(diào)控。Choi et al［18］和Meeran et al［19－20］研究發(fā)現(xiàn)hTERT啟動子區(qū)域的組蛋白在HAT的作用下發(fā)生乙?；蓪?dǎo)致DNA空間結(jié)構(gòu)處于松弛狀態(tài)，從而有利于轉(zhuǎn)錄因子與之結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄效率大大提高，即組蛋白乙酰化可激活hTERT基因的轉(zhuǎn)錄。相反，在HDAC作用下組蛋白去乙?；?，引起染色質(zhì)DNA高度凝縮，轉(zhuǎn)錄因子難于與之相應(yīng)的順式反應(yīng)元件結(jié)合，使hTERT轉(zhuǎn)錄受到抑制。Mao et al［21］研究表明NAD依賴性的組蛋白去乙?；窼irt1與c-myc轉(zhuǎn)錄因子的C端相互作用，導(dǎo)致c-myc體外和體內(nèi)去乙?；６疫@種脫乙?；饔么龠Mc-myc與其活化分子MAX結(jié)合，從而促進了hTERT啟動子上c-myc的轉(zhuǎn)錄激活。Choi et al［16］又發(fā)現(xiàn)HDAC抑制劑（HDACi）增強了HAT共激活復(fù)合體將乙?；D(zhuǎn)移到組蛋白賴氨酸Lys殘基的能力，導(dǎo)致核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)開放，從而激活或抑制hTERT等基因，最終促進了不同轉(zhuǎn)錄因子如CTCF、c-myc及MAD1等與啟動子結(jié)合。另也有研究［22］表明在正常細胞中TSA以Sp1依賴的方式誘導(dǎo)表達hTERT和端粒酶活性。

2.2 組蛋白甲基化有文獻報道另一重要形式組蛋白甲基化也調(diào)控hTERT表達。Atkinson et al［23］發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞中H3-K4三甲基化激活hTERT基因轉(zhuǎn)錄。Liu et al［24］對腫瘤細胞研究發(fā)現(xiàn)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（SMYD3）在hTERT啟動子調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。SMYD3使H3-K4發(fā)生三甲基化，募集HAT導(dǎo)致染色體構(gòu)象開放，從而有利于c-myc與Sp1結(jié)合；同時沉默SMYD3可減弱H3-K4甲基化和H3乙?；罱K抑制hTERT轉(zhuǎn)錄及端粒酶活性。Ge et al［25］也發(fā)現(xiàn)DNA甲基化和組蛋白H3-K9修飾影響c-myc與hTERT啟動子上E-box1位點結(jié)合，同時沉默c-myc明顯抑制hTERT表達。綜上所述，研究表明hTERT的表達可能是由表觀遺傳學(xué)（DNA甲基化和組蛋白修飾）及轉(zhuǎn)錄因子共同相互調(diào)控的結(jié)果。

3 非編碼RNA

3.1 microRNAsmicroRNAs也叫miRNAs或miRs，是一類由內(nèi)源基因編碼的長度為20～25個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在細胞分化、生物發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。隨著非編碼RNA，尤其是microRNAs成為基因表達調(diào)控的研究熱點，其在hTERT表達調(diào)控中的作用也逐漸被認(rèn)識。

Mitomo et al［26］首次報道了與端粒酶活性相關(guān)的miRNAs。研究者選取并分析正常甲狀腺及甲狀腺癌細胞中差異表達的miRNAs，最終較乳突狀甲狀腺癌相比，低分化型甲狀腺癌細胞中miR-138表達顯著下降。同時miRs在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-138的潛在靶點是hTERT。因此將miR-138前體分子轉(zhuǎn)入甲狀腺癌細胞中，應(yīng)用Western blot和熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測hTERT表達明顯下調(diào)。從而推測miR-138與hTERT mRNA的3＇UTR靶點結(jié)合抑制翻譯過程，進而下調(diào)hTERT表達和抑制端粒酶活性。miRNAs的活性具有細胞特異性，除miR-138以外，其他miRNAs在其他組織細胞中也參與調(diào)控hTERT活性。Miura et al［27］研究表明人染色體10p可能含有調(diào)控hTERT表達的基因，從而應(yīng)用細菌人工染色體克隆研究發(fā)現(xiàn)與正常肝細胞相比，肝癌細胞中RGM249（編碼miRNAs的前體基因，位于10p15.3區(qū)）高表達，基本與hTERT表達一致；同時發(fā)現(xiàn)RGM249可顯著降低hTERT mRNA水平。另外，Wang et al［28］研究表明miR-21在膠質(zhì)母細胞瘤的細胞增殖調(diào)控中起著十分重要的作用，并以STAT3依賴的方式調(diào)控hTERT表達影響細胞增殖。

3.2 長鏈非編碼RNA近年來研究［29］表明另一種非編碼RNA，TERRA（或TelRNA）參與端粒酶的調(diào)控。哺乳動物的TERRA分子是一段含有UUAGGG重復(fù)序列，大小為100～9 000 bp的長鏈非編碼RNA。研究認(rèn)為TERRA可能以兩種方式抑制端粒酶活性，一種是與它的互補性序列作用阻滯RNA部分（hTR），另一種是影響端粒區(qū)的異染色質(zhì)［30］。而Redon et al［31］同時也發(fā)現(xiàn)TERRA也可以hTR非依賴形式與hTERT相互作用改變其結(jié)構(gòu)從而抑制端粒酶活性。目前研究結(jié)果僅提示，非編碼RNA可能對hTERT起到調(diào)控，但還未能闡明它們是通過何種機制來發(fā)揮調(diào)控作用，這有待進一步探索。

4 前景與存在的問題

通過對腫瘤組織及細胞的研究，揭示了表觀遺傳學(xué)對hTERT基因表達的調(diào)控作用。這為進一步研究腫瘤的發(fā)生機制及診斷治療方法提供新途徑。如Widschwendter et al［32］研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者hTERT啟動子甲基化的預(yù)后遠差于未發(fā)生甲基化患者。但是調(diào)控hTERT表達是多重因素多種機制，未來還應(yīng)進一步探討hTERT啟動子的高甲基化狀態(tài)與其表達之間的具體關(guān)系，microRNA與DNA甲基化和組蛋白修飾如何相互作用調(diào)控hTERT表達等。

［1］ Flores I，Blasco M A.The role of telomeres and telomerase in stem cell aging［J］.FEBS Lett，2010，584（17）：3826－30.

［2］ Beatty G L，Vonderheide R H.Telomerase as a universal tumor antigen for cancer vaccines［J］.Expert Rev Vaccines，2008，7（7）：881－7.

［3］ Shay J，Bacchetti S.A survey of telomerase activity inhuman cancer［J］.Eur J Cancer，1997，33（5）：787－91.

［4］ Bryce L A，Morrison N，Hoare S F，et al.Mapping of the gene for thehuman telomerase reverse transcriptase，hTERT，to chromosome 5p15.33 by fluorescence in situhybridization［J］.Neoplasia，2000，2（3）：197－201.

［5］ Daniel M，Peek G W，Tollefsbol T O.Regulation of thehuman catalytic subunit of telomerase（hTERT）［J］.Gene，2012，498（2）：135－46.

［6］ Nomoto K，Maekawa M，Sugano K，et al.Methylation status and expression ofhuman telomerase reverse transcriptase mRNA in relation tohypermethylation of the p16 gene in colorectal cancers as analyzed by bisulfite PCR-SSCP［J］.Jpn J Clin Oncol，2002，32（1）：3－8.

［7］ Cong Y S，Wen J，Bacchetti S.Thehuman telomerase catalytic subunithTERT：organization of the gene and characterization of the promoter［J］.Hum Mol Genet，1999，8（1）：137－42.

［8］ Liu L，Lai S，Andrews L G，et al.Genetic and epigenetic modulation of telomerase activity in development and disease［J］.Gene，2004，340（1）：1－10.

［9］ Liu L，Saldanha S N，Pate M S，et al.Epigenetic regulation ofhuman telomerase reverse transcriptase promoter activity during cellular differentiation［J］.Genes Chromosomes Cancer，2004，41（1）：26－37.

［10］Lopatina N G，Poole J C，Saldanha S N，et al.Control mechanisms in the regulation of telomerase reverse transcriptase expression in differentiatinghuman teratocarcinoma cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2003，306（3）：650－9.

［11］Dessain S K，Yu H，Reddel R R，et al.Methylation of thehuman telomerase gene CpG island［J］.Cancer Res，2000，60（3）：537－41.

［12］Devereux T R，Horikawa I，Anna C H，et al.DNA methylation analysis of the promoter region of thehuman telomerase reverse transcriptase（hTERT）gene［J］.Cancer Res，1999，59（24）：6087－90.

［13］Guilleret I，Yan P，Grange F，et al.Hypermethylation of thehuman telomerase catalytic subunit（hTERT）gene correlates with telomerase activity［J］.Int J Cancer，2002，101（4）：335－41.

［14］De Wilde J，Kooter J M，Overmeer R M，et al.hTERT promoter activity and CpG methylation in HPV-induced carcinogenesis［J］.BMC Cancer，2010，10（1）：271.

［15］Renaud S，Loukinov D，Abdullaev Z，et al.Dual role of DNA methylation inside and outside of CTCF-binding regions in the transcriptional regulation of the telomerasehTERT gene［J］.Nucleic Acids Res，2007，35（4）：1245－56.

［16］Choi J H，Min N Y，Park J，et al.TSA-induced DNMT1 downregulation represseshTERT expression via recruiting CTCF into demethylated core promoter region ofhTERT in HCT116［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，391（1）：449－54.

［17］Zinn R L，Pruitt K，Eguchi S，et al.hTERT is expressed in cancer cell lines despite promoter DNA methylation by preservation of unmethylated DNA and active chromatin around the transcription start site［J］.Cancer Res，2007，67（1）：194－201.

［18］Choi K C，Jung M G，Lee Y H，et al.Epigallocatechin-3-gallate，ahistone acetyltransferase inhibitor，inhibits EBV-induced B lymphocyte transformation via suppression of RelA acetylation［J］.Cancer Res，2009，69（2）：583－92.

［19］Meeran S M，Ahmed A，Tollefsbol T O.Epigenetic targets of bioactive dietary components for cancer prevention and therapy［J］.Clin Epigenetics，2010，1（3－4）：101－16.

［20］Meeran S M，Patel S N，Tollefsbol T O.Sulforaphane causes epigenetic repression ofhTERT expression inhuman breast cancer cell lines［J］.PLoS One，2010，5（7）：e11457.

［21］Mao B，Zhao G，Lv X，et al.Sirt1 deacetylates c-Myc and promotes c-Myc/Max association［J］.Int J Biochem Cell Biol，2011，43（11）：1573－81.

［22］Kyo S，Takakura M，F(xiàn)ujiwara T，et al.Understanding and exploitinghTERT promoter regulation for diagnosis and treatment ofhuman cancers［J］.Cancer Sci，2008，99（8）：1528－38.

［23］Atkinson S P，Hoare S F，Glasspool R M，et al.Lack of telomerase gene expression in alternative lengthening of telomere cells is associated with chromatin remodeling of thehTR andhTERT gene promoters［J］.Cancer Res，2005，65（17）：7585－90.

［24］Liu C，F(xiàn)ang X，Ge Z，et al.The telomerase reverse transcriptase（hTERT）gene is a direct target of thehistone methyltransferase SMYD3［J］.Cancer Res，2007，67（6）：2626－31.

［25］Ge Z，Li W，Wang N，et al.Chromatin remodeling：recruitment ofhistone demethylase RBP2 by Mad1 for transcriptional repression of a Myc target gene，telomerase reverse transcriptase［J］.FASEB J，2010，24（2）：579－86.

［26］Mitomo S，Maesawa C，Ogasawara S，et al.Downregulation of miR-138 is associated with overexpression ofhuman telomerase reverse transcriptase protein inhuman anaplastic thyroid carcinoma cell lines［J］.Cancer Sci，2008，99（2）：280－6.

［27］Miura N，Sato R，Tsukamoto T，et al.A noncoding RNA gene on chromosome 10p15.3 may function upstream ofhTERT［J］.BMC Mol Biol，2009，10（1）：5.

［28］Wang Y Y，Sun G，Luo H，et al.MiR-21 modulateshTERT through a STAT3-dependent manner on glioblastoma cell growth［J］.CNS Neurosci Ther，2012，18（9）：722－8.

［29］Reig-Viader R，Brie?o-Enríquez M A，Khouriauli L，et al.Telomeric repeat-containing RNA and telomerase inhuman fetal oocytes［J］.Hum Reprod，2013，28（2）：414－22.

［30］Ng L J，Cropley J E，Pickett H A，et al.Telomerase activity is associated with an increase in DNA methylation at the proximal subtelomere and a reduction in telomeric transcription［J］.Nucleic Acids Res，2009，37（4）：1152－9.

［31］Redon S，Reichenbach P，Lingner J.The non-coding RNA TERRA is a natural ligand and direct inhibitor ofhuman telomerase［J］.Nucleic Acids Res，2010，38（17）：5797－806.

［32］Widschwendter A，Müller H M，Hubalek M M，et al.Methylation status and expression ofhuman telomerase reverse transcriptase in ovarian and cervical cancer［J］.Gynecol Oncol，2004，93（2）：407－16.

R 349.64

A

1000－1492（2014）04－0554－04

2013－10－28接收

國家自然科學(xué)基金（編號：21272008、81072686、81273526）

安徽醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院、2肝病研究所，合肥 230032

吳小琴，女，碩士研究生；李 俊，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：lj＠ahmu.edu.cn