對(duì)山東某豬場(chǎng)一起仔豬腹瀉的流行病學(xué)調(diào)查

（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

對(duì)山東某豬場(chǎng)一起仔豬腹瀉的流行病學(xué)調(diào)查

張 志，董雅琴，劉 爽，吳發(fā)興，邵衛(wèi)星，李曉成

（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

本文針對(duì)發(fā)生腹瀉疫情的某豬場(chǎng)開(kāi)展了實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)表明該疫情的病原為豬流行性腹瀉病毒。流行病學(xué)調(diào)查顯示，此次腹瀉疫情于2013年11月份開(kāi)始暴發(fā)，2014年3月份結(jié)束，發(fā)病豬的種類(lèi)具有明顯的次序，育肥豬首先發(fā)生，其次是母豬，新生仔豬最后發(fā)??；發(fā)病率和死亡率與豬的種類(lèi)、日齡密切相關(guān)，育肥豬和母豬發(fā)病后僅出現(xiàn)腹瀉癥狀而不死亡，仔豬發(fā)病后腹瀉癥狀明顯而且死亡率隨著年齡的增長(zhǎng)急劇下降，3日齡以下仔豬死亡率可達(dá)100%，1周齡仔豬死亡率降至72.73%，12日齡仔豬死亡率僅有10%。對(duì)豬場(chǎng)風(fēng)險(xiǎn)因素分析表明，飼料車(chē)輛直接進(jìn)入豬場(chǎng)、賣(mài)豬車(chē)輛與飼養(yǎng)人員接觸、糞便通道沒(méi)有封閉、飼養(yǎng)人員流動(dòng)等是影響此次腹瀉疫情的高風(fēng)險(xiǎn)因素，通過(guò)降低高風(fēng)險(xiǎn)因素很好地控制了疫病。

豬流行性腹瀉；流行病學(xué)調(diào)查；檢測(cè)

豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diahorrea Virus，PEDV）是引起豬嘔吐、腹瀉和脫水為主要臨床癥狀特征的豬腸道傳染病病原，哺乳仔豬、架子豬或育肥豬等各年齡段均可發(fā)病，但哺乳仔豬發(fā)病和死亡最為嚴(yán)重[1]。2011年以來(lái)，因豬流行性腹瀉病毒引起的腹瀉在我國(guó)豬群迅速傳播，仔豬一旦感染發(fā)病，死亡率可達(dá)60%～100%，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-4]。2014年3月，山東某養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)腹瀉疫情，仔豬出現(xiàn)大規(guī)模的腹瀉、嘔吐、死亡等癥狀，該場(chǎng)迅速采樣送我中心進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)證實(shí)樣品全部為豬流行性腹瀉病毒陽(yáng)性，為進(jìn)一步尋找病原來(lái)源，提出防治措施，我中心對(duì)該場(chǎng)又進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，并針對(duì)此次疫情提出了針對(duì)性的防控建議。

1 材料和方法

1.1 樣品來(lái)源

7頭呈現(xiàn)腹瀉癥狀的死亡小豬，日齡分別為2-12日齡，來(lái)自山東某豬場(chǎng)，剖檢后取其腸道和糞便樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1.2 試劑

PEDV RT-PCR的引物由本實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)，RNA提取試劑盒TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司，反

轉(zhuǎn)錄酶AMV、Taq酶等購(gòu)自TakaRa公司，其余試劑均為分析純產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)室PEDV 核酸檢測(cè)

1.3.1 豬糞便樣品的處理和RNA的提取

每一份糞便和腸道樣品均在一起，按照1∶5的比例加入PBS緩沖液，5000rpm 4℃離心10min，然后吸出上清液用于提取RNA和接種細(xì)胞。RNA的提取根據(jù)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，即取糞便懸液250μL于1.5mL的離心管中，加入750μL TRIzol（Invitrogen公司），混勻，室溫放置5min；再加入200μL氯仿，振蕩混勻，室溫放置10min；12000r-min、4℃離心15min，取上清500μL，加等體積-20℃預(yù)冷的異丙醇室溫靜置10min或-20℃靜置30min，12000r-min、4℃離心10min；棄上清，加入75%冰冷乙醇（DEPC處理水配制），8000～9000g離心5min；棄上清，倒置風(fēng)干，用20μLDEPC處理水溶解，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 檢測(cè)引物

根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]，設(shè)計(jì)2對(duì)引物，進(jìn)行巢氏PCR擴(kuò)增，一擴(kuò)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)計(jì)為854 bp，序列為：L12：5’-ACACCTATAGGGCGCCTGTA-3’；L13：5’-AACCCTAAGAGGGGCATAGA-3’；二擴(kuò)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)為412 bp，其序列為：PA：5’-GGGCGCCTGTATAGAGTTTA-3’；PB：5’-AGACCACCAAGAATGTGTCC-3’。引物由上海生工合成。使用時(shí)稀釋至20μm。

1.3.3 RNA病毒的檢測(cè)

首先制備cDNA，cDNA反應(yīng)體系為：RNA 5μL，dNTP 4μL，5×AMV Buffer 4μL，反轉(zhuǎn)錄引物L(fēng)131μL，AMV 0.5μL，HPRI 0.5μL，加入適量DEPC水，總體積為20μL。42℃恒溫水浴鍋中水浴1.5h，取出后放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增：取反轉(zhuǎn)錄的cDNA 2.0μL作為模板，加入10×PCR Buffer 2.5μL，dNTPs（10 mmol-L）2μL，分別加入PEDV的引物L(fēng)12和L13各0.5μL，Ex-Taq DNA聚合酶0.25μL，ddH2O 17.25μL?；靹蚝蟛捎萌缦鲁绦蜻M(jìn)行PCR擴(kuò)增：94℃預(yù)變性3min；94℃ 40s，56℃1min，72℃ 1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。巢式PCR擴(kuò)增：取上述PCR產(chǎn)物0.5μL，用引物PA和PB進(jìn)行二次擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性3 min；94℃ 30s，56℃30s，72℃ 30s，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.3.4 PCR產(chǎn)物檢測(cè) 取10μL 一次和二次擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀(guān)察有無(wú)特異性條帶。

1.4 流行病學(xué)調(diào)查

發(fā)放和填寫(xiě)《豬群腹瀉等常見(jiàn)病流行病學(xué)調(diào)查表》，進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查和談話(huà)，重點(diǎn)調(diào)查發(fā)病史、發(fā)病背景、發(fā)病范圍、發(fā)病率、死亡率、豬場(chǎng)與外界的接觸史、豬場(chǎng)衛(wèi)生管理情況、防疫管理措施、生產(chǎn)記錄、用藥記錄以及現(xiàn)有疫苗的臨床免疫保護(hù)效果等，對(duì)返回的數(shù)據(jù)及時(shí)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 分析方法

用描述性流行病學(xué)方法和Excel軟件對(duì)采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 樣品的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果

該豬場(chǎng)共送來(lái)7頭死亡仔豬剖檢，分別來(lái)自7頭不同母豬，這些仔豬生前均出現(xiàn)嘔吐、拉稀、脫水等癥狀，剖檢后發(fā)現(xiàn)仔豬的腸道變薄腫脹（7/7）、充滿(mǎn)黃白色液體（7/7）、腦回溝變深充血和彌漫性出血（7/7）、胃內(nèi)充滿(mǎn)白色乳樣凝塊（5/7），其他組織沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯病變。每頭仔豬分別采集腦組織、糞便和一段小腸（約30cm長(zhǎng)）混勻后進(jìn)行多種病原檢測(cè)，結(jié)果7份樣品均檢測(cè)到了PEDV，而沒(méi)有檢測(cè)到TGEV、CSFV、PRRSV、PRV等病原。

2.2 流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果

該豬場(chǎng)2008年建設(shè)和投入生產(chǎn)，引種后采取自繁自養(yǎng)的養(yǎng)殖模式，現(xiàn)存欄公豬17頭，能繁母豬700頭，后備母豬120頭，斷奶前仔豬800頭，保育豬1200頭，育肥豬4300頭。豬場(chǎng)有專(zhuān)職獸醫(yī)，養(yǎng)殖環(huán)境相對(duì)獨(dú)立，有門(mén)禁、消毒設(shè)施，采取進(jìn)場(chǎng)前消毒、換膠鞋等衛(wèi)生防疫措施。妊娠母豬產(chǎn)前20和40天分別免疫豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎二聯(lián)滅活苗。2013年12月份，豬場(chǎng)開(kāi)始出現(xiàn)腹瀉，抗生素治療無(wú)效。從發(fā)病時(shí)間看，最初為育肥豬，其次為母豬和仔豬，母豬和育肥豬基本沒(méi)有死亡，

呈一過(guò)型，但仔豬死亡率很高，可達(dá)70%以上。

2.3 病例的時(shí)間分布

該場(chǎng)豬群出現(xiàn)腹瀉的時(shí)間與豬的種類(lèi)密切相關(guān)。首先是育肥豬，然后是母豬，最后是仔豬。時(shí)間分布詳見(jiàn)圖1。

圖1不同豬發(fā)病和結(jié)束時(shí)間

表1不同種類(lèi)豬腹瀉發(fā)生的狀況

表2仔豬日齡與發(fā)病的關(guān)系

圖2豬場(chǎng)平面圖

2013年11月5日左右，育肥后期豬（約200斤）最先開(kāi)始發(fā)病，接著育肥前期、育肥中期豬和保育豬發(fā)病，主要癥狀為不吃料、拉稀、水樣腹瀉，持續(xù)1周，然后自愈，截至11月22日，無(wú)新發(fā)病例出現(xiàn)，4300頭育肥豬共有3912頭豬出現(xiàn)發(fā)病，發(fā)病率為91%，1200頭保育豬共有1056頭發(fā)病，發(fā)病率為88%，但沒(méi)有一頭豬死亡。2013年12月15日，母豬開(kāi)始出現(xiàn)腹瀉癥狀，至12月31日，母豬無(wú)新發(fā)病例出現(xiàn)，700頭母豬中有50頭表現(xiàn)拉稀，發(fā)病率為7.2%，但一般2天后自愈，呈現(xiàn)一過(guò)性，無(wú)母豬死亡。2014年1月，仔豬開(kāi)始集中發(fā)病，至3月中旬，除了50頭發(fā)病母豬所產(chǎn)仔豬以外，其余母豬所產(chǎn)的新生仔豬都發(fā)病。1-3月期間，共有6棟產(chǎn)仔舍進(jìn)行使用，每半月輪換一批母豬，先后有220頭母豬生產(chǎn)，共產(chǎn)活仔2089頭，3月上旬第6棟母豬舍在使用，該棟有40頭母豬存欄，已經(jīng)生產(chǎn)23窩，其中16窩仔豬（163頭）也出現(xiàn)拉稀，但呈一過(guò)型，沒(méi)有出現(xiàn)仔豬死亡，其余7窩（80頭）的仔豬出現(xiàn)明顯的腹瀉癥狀，10日齡以上仔豬不死亡，但3日齡以下仔豬100%死亡，這7窩仔豬的平均死亡率為61.25%，如果考慮到16窩一過(guò)性仔豬，總體平均死亡率為20.16%，詳見(jiàn)表1。

進(jìn)一步分析這7頭母豬所產(chǎn)仔豬的發(fā)病和死亡時(shí)間，可以發(fā)現(xiàn)，仔豬日齡越大，死亡率越低，3日齡以?xún)?nèi)發(fā)病的仔豬死亡率為100%；1周左右時(shí)，發(fā)病率降至72.73%，當(dāng)達(dá)到12日齡時(shí)，死亡率只有10%（表2）。

2.4 病例的空間分布

該豬場(chǎng)占地面積72畝，離周邊最近居民1.2公里，隔離屏障相對(duì)較好，豬場(chǎng)分為生產(chǎn)區(qū)和辦公區(qū)，但二者之間只有一條道路相隔，沒(méi)有明顯的隔離屏障（豬場(chǎng)的平面圖如圖2所示）。此次疫情中，最先發(fā)病的是育肥舍5，然后是育肥舍6、2、1、3、4、7、8、9、10和保育舍。育肥舍與產(chǎn)仔舍的最短距

離為250m。產(chǎn)仔舍的發(fā)病順序是2、4、5、3、1。產(chǎn)仔舍6用于50頭出現(xiàn)腹瀉癥狀的母豬，該50頭母豬所產(chǎn)仔豬均沒(méi)有發(fā)病。從圖中可以明顯地看出，疫病是從育肥舍傳向母豬舍，然后傳向產(chǎn)仔舍，顯然育肥舍5是最初的傳染源。

2.5 病例的群間分布

此次腹瀉疫情，涵蓋了育肥豬、母豬和仔豬，但不同種類(lèi)的豬出現(xiàn)的癥狀、持續(xù)時(shí)間和最終轉(zhuǎn)歸結(jié)果明顯不同，差異非常顯著。育肥豬發(fā)病快，傳播迅速，感染率高，一般呈一過(guò)性，癥狀主要表現(xiàn)水樣腹瀉，病程1周左右，能夠自愈，沒(méi)有出現(xiàn)死亡；母豬呈散在發(fā)生，發(fā)病率低，癥狀較輕，以拉稀為主，病程短，多2天自愈，沒(méi)有出現(xiàn)死亡；仔豬則表現(xiàn)發(fā)病快，傳播迅速，癥狀嚴(yán)重，表現(xiàn)水樣腹瀉、嚴(yán)重脫水、極度消瘦等，一窩仔豬往往全部發(fā)病，死亡率與豬的日齡密切相關(guān)，出生3日齡內(nèi)出現(xiàn)腹瀉癥狀，死亡率100%；出生1周內(nèi)出現(xiàn)腹瀉癥狀，死亡率可降至60%；超過(guò)10日齡的仔豬，死亡率不超過(guò)20%。

2.6 風(fēng)險(xiǎn)因素分析

在調(diào)查中，結(jié)合該豬場(chǎng)的養(yǎng)殖模式考慮了以下幾種引發(fā)疫病發(fā)生和傳播的風(fēng)險(xiǎn)因素，以及這些風(fēng)險(xiǎn)因素在該養(yǎng)豬場(chǎng)引發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的可能性高低，其中，風(fēng)險(xiǎn)性比較高的因素有飼料車(chē)輛直接進(jìn)入豬場(chǎng)、賣(mài)豬車(chē)輛與飼養(yǎng)人員接觸、糞便通道沒(méi)有封閉、飼養(yǎng)人員流動(dòng)等，詳見(jiàn)表3。

表3豬場(chǎng)腹瀉風(fēng)險(xiǎn)因素分析表

通過(guò)此次調(diào)查，針對(duì)風(fēng)險(xiǎn)性高的風(fēng)險(xiǎn)因素，我們提出了加強(qiáng)豬舍消毒，更換腹瀉疫苗，母豬強(qiáng)化免疫，嚴(yán)防外來(lái)車(chē)輛進(jìn)入豬場(chǎng)等措施，該豬場(chǎng)的腹瀉很快停止，取得了明顯的效果。

3 討論

流行病學(xué)調(diào)查是流行病學(xué)的一種基本研究方法，旨在通過(guò)調(diào)查了解疫病的空間、時(shí)間和群間分布，判斷病因，提出相應(yīng)的防控措施。本文也是作者將流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)相結(jié)合的一種嘗試，通過(guò)這種方式，既能夠明確病因，確定風(fēng)險(xiǎn)因素，也能夠更有針對(duì)性地提出有效合理的防控措施[6-7]。

2011年以來(lái)，我國(guó)部分豬場(chǎng)暴發(fā)了仔豬腹瀉，一些學(xué)者先后從腹瀉樣品中檢測(cè)到PEDV，甚至PEDV的陽(yáng)性率可達(dá)80%以上[3-4]。但直到2013年底，仔豬腹瀉仍在我國(guó)部分豬場(chǎng)肆虐，最近美國(guó)又大規(guī)模暴發(fā)了豬流行性腹瀉，這些結(jié)果提示，僅僅依靠病原的分離鑒定并不能完全阻止腹瀉疫情的暴發(fā)，必須開(kāi)展相關(guān)的流行病學(xué)調(diào)查。

2011—2013年，我中心對(duì)全國(guó)29個(gè)省份的7021個(gè)豬場(chǎng)開(kāi)展了腹瀉流行病學(xué)問(wèn)卷調(diào)查，結(jié)果表明有4060個(gè)豬場(chǎng)（57.83%）發(fā)生過(guò)腹瀉，而且豬場(chǎng)免疫豬流行性腹瀉-豬傳染性胃腸炎二聯(lián)活疫苗或二聯(lián)滅活苗保護(hù)仔豬的效果并不顯著，本文的調(diào)查也顯示同樣的結(jié)果。另外，本文調(diào)查也顯示，育肥豬特別是距離售豬口最近的育肥豬是此次疫情發(fā)生的傳染源。據(jù)豬場(chǎng)主回憶，2013年10月份，每隔1周，該豬場(chǎng)都會(huì)出售一批豬，最近一次10月25日時(shí)，有一頭豬趕上車(chē)輛后又逃回豬場(chǎng)，這頭豬當(dāng)時(shí)沒(méi)有出售，我們推測(cè)這頭豬很可能是此次疫情的污染源。其原因在于去年冬季，山東省不少豬場(chǎng)發(fā)生了豬流行性腹瀉，一旦豬場(chǎng)發(fā)病后，場(chǎng)主往往急于銷(xiāo)售病豬，豬販子收購(gòu)病豬以后，裝載該病豬的車(chē)輛就會(huì)攜帶豬流行性腹瀉病原，加上冬季病原不易滅活，病原可以長(zhǎng)時(shí)間存活，并隨著車(chē)輛的運(yùn)輸而長(zhǎng)距離傳播。當(dāng)豬販子的載豬車(chē)輛在不同的豬場(chǎng)之間來(lái)回流動(dòng)購(gòu)豬時(shí)，就會(huì)成為下一家豬場(chǎng)的傳染源。如果豬場(chǎng)的衛(wèi)生防疫措施不嚴(yán)格、豬場(chǎng)內(nèi)的糞便運(yùn)輸和處理等管理措施不當(dāng)，就會(huì)導(dǎo)致全場(chǎng)暴發(fā)疫病。

針對(duì)相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素，經(jīng)實(shí)施加強(qiáng)豬舍消毒、更換腹瀉疫苗、嚴(yán)防外來(lái)車(chē)輛進(jìn)入豬場(chǎng)等措施，該豬場(chǎng)疫情停止，證實(shí)我們對(duì)風(fēng)險(xiǎn)因素的判斷是正確的。

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A epidemic survey of porcine diarrhea in a pig farm

Zhang Zhi，Dong Yaqin，Liu Shuang，Wu Faxing，Shao Weixing，Li Xiaocheng

（China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao 266032）

A epidemic survey and laboratory detection were carried out for a pig farm which occurred diarrhea. The detection of virus was conf rmed the epidemic agent was porcine epidemic diarrhea virus. Further information of survey showed that this outbreak of diarrhea took place during Nov 2013 and Mar 2014 in sequence of fattening pigs，sows and piglets. However，the morbidity and mortality of different pigs were closely related to the pieces and birth days. Fattening pigs and sows had no deaths although they had been infected，while the piglet less than 3 old days had 100 percent mortality. If the piglets grown up to one week and 12 days，the mortality would drop to 72.73% and 10% separately. The risk analysis indicated that vehicles directly went into pig farms，a closed contact with their keepers by selling pigs，unclosed transfer channel of feces and urine，circulating of feed workers were all high risk factors inf uencing the diarrhea outbreak，which could be reduced to control the disease.

porcine epidemic diarrhea；epidemic survey；detection

S852.65

：B

：1005-944X（2014）10-0052-05

青島民生計(jì)劃項(xiàng)目（13-1-3-91-nsh）

李曉成