（山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島 266002）

荷斯坦奶牛脊椎畸形綜合征焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法建立與應(yīng)用

王 群 ，孫 濤，鄭小龍，張曉文，姜 帆，趙玉然

（山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島 266002）

為建立一種快速高通量的荷斯坦奶牛脊柱畸形綜合征（complex vertebral malformation，CVM）的分子檢測(cè)方法，根據(jù)CVM是由于SLC35A3基因第4外顯子559位處發(fā)生G→T突變的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，利用Assay Design SW軟件設(shè)計(jì)了1對(duì)PCR引物和1條測(cè)序引物對(duì)三種不同基因型的基因材料進(jìn)行測(cè)序分析，建立焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法。對(duì)55份進(jìn)境荷斯坦奶牛血樣進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有1例為隱性基因攜帶者，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，其DNA序列與焦磷酸測(cè)序檢測(cè)結(jié)果一致。研究表明該方法是一種有效的新方法，可用于荷斯坦奶牛脊椎畸形綜合征的檢測(cè)。

脊椎畸形綜合征；焦磷酸測(cè)序；荷斯坦奶牛

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒。未突變純合子（A/A）基因材料為構(gòu)建的含有部分SLC35A3基因質(zhì)粒pMD-SLC35A3；CVM純合子（a/a）基因材料為人工致突后質(zhì)粒pMD-CVM；CVM攜帶者（A/a）基因材料為pMD-SLC35A3與pMD-CVM兩者等比混合物。所有質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 樣品采集。從2011—2012年山東口岸由澳大利亞進(jìn)境的荷斯坦奶牛血樣中隨機(jī)抽取55份全血樣品，于-20℃保存。

1.1.3 試劑和儀器設(shè)備。DNeasy Blood & Tissue Kit、Taq PCR Master Mix Kit、PyroMark Gold Q96 SQA Reagents（1×96）購(gòu)自Qiagen公司；鏈霉親和素包被磁珠購(gòu)自GE Health-care BioScience AB公司；硅膠膜型質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、DNA Marker DL2000購(gòu)自大連寶生物有限公司；其它常規(guī)化學(xué)試劑購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。

Sigma1-15普通離心機(jī)，Sigma公司產(chǎn)品；Mini-SUB凝膠電泳裝置，Bio-Rad公司；Gel-Doc2000凝膠成像分析系統(tǒng)，Bio-Rad公司產(chǎn)品；PYROMARK ID定量遺傳分析系統(tǒng)，Qiagen公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 相關(guān)基因的生物信息學(xué)分析及測(cè)序引物的設(shè)計(jì)。查詢Genbank中登錄號(hào)AY160683的牛SLC35A3全基因序列，根據(jù)CVM致病的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，將致病的位點(diǎn)第4外顯子559位處堿基作為目的核苷酸序列，通過 Assay Design SW 軟件設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物和測(cè)序引物。表1中目的核苷酸序列中斜線兩側(cè)的黑體堿基表示同位點(diǎn)堿基可能突變情況。

表1引物序列

1.2.2 涵蓋突變核苷酸位點(diǎn)的基因片段的PCR擴(kuò)增。分別以A/A、a/a和A/a基因材料為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：2×PCR Mix 25μL，上、下游擴(kuò)增引物（ 20 pmol/L）各2μL，模板 DNA 0.5μL，雙蒸水補(bǔ)足體積至50μL。

PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min； 94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸 30s，50個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃終止反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 焦磷酸測(cè)序。使用50μL標(biāo)記有生物素的PCR產(chǎn)物與200μg鏈霉親和素包被的磁珠，在室溫25℃下孵育20min。用vacuum prep tool將與磁珠結(jié)合后的PCR產(chǎn)物吸起，然后在70%乙醇中清洗5s；變性緩沖液洗5s；最后移到清洗緩沖液中清洗10s；vaccum prep tool放入含有測(cè)序引物的板中，搖動(dòng)，釋放磁珠。將樣品放入80℃烘箱2min，再冷卻到室溫。此時(shí)將分離的單鏈 DNA 上機(jī)使用SNP檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)。對(duì)三種基因型的基因材料進(jìn)行焦磷酸測(cè)序重復(fù)試驗(yàn)，分別各重復(fù)3次，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 方法的應(yīng)用。對(duì)山東地區(qū)進(jìn)境的荷斯坦奶牛55份全血樣品提取基因組，按照所建立的方法先進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。然后進(jìn)行PCR產(chǎn)物的單鏈分離，上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)Assay Design SW 軟件設(shè)計(jì)的擴(kuò)增引物擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為126bp，經(jīng)過摸索，PCR擴(kuò)增條件及體系如1.2中所描述，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠檢測(cè)，大小與目的條帶一致，特異性良好。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2 焦磷酸測(cè)序

測(cè)序片段經(jīng)過單鏈分離純化后經(jīng)過PyroMark ID系統(tǒng)測(cè)序能夠檢測(cè)出片段的DNA序列，按照已知的基因片段的序列，可以迅速識(shí)別所測(cè)的基因型，三種基因型的測(cè)序結(jié)果如圖2所示。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

在一周的時(shí)間內(nèi)對(duì)三種不同基因型的基因材料進(jìn)行3次SNP檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與已知基因型一致。測(cè)序結(jié)果與序列核苷酸同源性達(dá)到100%，3次檢測(cè)結(jié)果之間的CV值小于5%，該方法具有很好的重復(fù)性。

2.4 方法的應(yīng)用

55份樣品PCR擴(kuò)增均得到單一的大小正確的電泳條帶，利用設(shè)計(jì)的的焦磷酸測(cè)序引物進(jìn)行SNP檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了1份A/a基因型的樣品，將樣品PCR產(chǎn)物送去測(cè)序結(jié)果與檢測(cè)結(jié)果一致（圖3）。

3 討論

CVM是一種常染色體隱性遺傳病，經(jīng)過患牛的系譜追蹤發(fā)現(xiàn)，該突變基因來源于美國(guó)的著名公牛Carlin-MIvanhoe Bell（1667366）及其父親Pen-state Ivanhoe Star（1441440），基因分型顯示，它們都是CVM的雜合子，由于其具有優(yōu)良的生產(chǎn)性能，因此其精子被廣泛應(yīng)用于全球的奶牛育種業(yè)，從而也造成了有害基因的廣泛傳播[10-11]。

我國(guó)每年從澳大利亞進(jìn)口牛數(shù)萬頭，同時(shí)也從國(guó)外進(jìn)口優(yōu)良牛精液進(jìn)行育種，如果母牛是CVM的攜帶者，其后代公牛也有可能成為CVM的攜帶者，如果這樣的攜帶者被培育為種公牛，那么Bell的“故事”將再次上演。因此，我們不僅需要對(duì)育種公牛進(jìn)行篩查，同時(shí)對(duì)于育種母牛也需要對(duì)其基因型進(jìn)行鑒定，盡量排除CVM攜帶者作為母本的可能，將CVM的傳播從根源進(jìn)行控制。

圖2.三種基因型焦磷酸測(cè)序結(jié)果

表2三種基因型基因材料檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性比較

圖3 CVM攜帶者焦磷酸測(cè)序及測(cè)序結(jié)果

本研究根據(jù)CVM的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，建

立了焦磷酸測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于CVM檢測(cè)的方法。該方法不同于Sugar法測(cè)序，具有無需制膠、無需毛細(xì)管、無需熒光染料和同位素的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)它還具有高通量、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)靈活、序列分析簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)[12-13]。該方法操作簡(jiǎn)便，可以用于對(duì)CVM不同基因型進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)方法具有很好的重復(fù)性，可以應(yīng)用于CVM基因型分型、攜帶者篩查及奶牛育種工作中。

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Development and Application of Pyrosequencing for Detecting Holstein Bovine Complex Vertebral Malformation

Wang Qun，Sun Tao，Zheng Xiaolong，Zhang Xiaowen，Jiang Fang，Zhao YuRan

（Shandong Exit and Entry Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao，Shandong 266002）

To develop a rapid and high-flux molecular method for detection of complex vertebral malformation（CVM），one pair of PCR primers and one sequencing primer were designed according to the gene sequence of bovine SLC35A3 gene by the Assay Design SW software. The PCR products of three different genotypes were detected via pyrosequencing method. There was one CVM carrier detected in 55 blood samples from imported Holstein bovine population. The pyrosequencing result was conf rmed by sequencing of PCR product of the CVM carrier.

CVM；pyrosequencing；Holstein bovine

S858.23；Q7

：A

：1005-944X（2014）10-0070-04

本課題為國(guó)家質(zhì)檢總局科技項(xiàng)目（2012IK016）

脊柱畸形綜合征（complex vertebral malformation，CVM）是奶牛的一種常染色體隱形遺傳性疾病。該病2000年由丹麥學(xué)者Agerholm首次報(bào)道[1]，隨后在全球其他國(guó)家也相繼有所報(bào)道[2-4]。Thomsen等證實(shí)了牛CVM 是由于編碼UDP-N-乙酰葡糖胺載體的溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)家族35-3（solute carrier family 35 member 3，SLC35A3）基因的第4外顯子559位處堿基發(fā)生G→T突變，導(dǎo)致編碼蛋白的180位處纈氨酸置換為苯丙氨酸，致使異常的核苷酸糖轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體[6]。CVM的主要臨床表現(xiàn)為早產(chǎn)、死胎及多見于妊娠260天前的流產(chǎn)，對(duì)奶牛的繁殖性狀、返情率等有較嚴(yán)重的影響。CVM的出生率很低，出生的患病犢牛脊椎彎曲畸形，成活率為零[7]。由于該病隱性缺陷基因攜帶者不表現(xiàn)任何臨床癥狀，隱形缺陷基因可遺傳給子代個(gè)體，只有當(dāng)子代出現(xiàn)隱形純合子時(shí)才會(huì)被發(fā)現(xiàn)并淘汰，這將會(huì)給奶牛業(yè)的發(fā)展造成巨大的損失，同時(shí)也不利于奶牛育種的發(fā)展。

目前，國(guó)際上許多國(guó)家已經(jīng)開始進(jìn)行奶牛中CVM攜帶者的篩查工作，主要檢測(cè)方法為ASPCR、PCR-SSCP和基因測(cè)序[6-9]，這些方法不適合大規(guī)模批量檢測(cè)，本研究利用PCR-焦磷酸測(cè)序技術(shù)，擬建立一種快速高通量檢測(cè)CVM的方法。