奶牛隱性乳房炎診斷液中陰離子活性物的含量測定

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室/甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅蘭州 730050）

奶牛隱性乳房炎診斷液中陰離子活性物的含量測定

李新圃，羅金印，李宏勝，楊 峰

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室/甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅蘭州 730050）

【目的】以含量測定為重點，開展奶牛隱性乳房炎診斷液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，為規(guī)范診斷液的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)提供參考。【方法】建立直接兩相滴定法測定奶牛隱性乳房炎診斷液中的陰離子活性物含量，并以診斷液LMT為例，進行方法的準(zhǔn)確度、精密度和專屬性評價?！窘Y(jié)果】準(zhǔn)確度分析結(jié)果顯示，RE為-0.86%（-3.88%～3.06%）；精密度分析結(jié)果顯示，日內(nèi)RSD為0.57%～3.14%，日間RSD為2.19%；專屬性分析結(jié)果顯示，LMT中的輔料成分不影響陰離子活性物的測定。直接兩相滴定法測定LMT中的陰離子活性物，具備必要的準(zhǔn)確度、精密度和專屬性。【結(jié)論】因為無論是組成還是技術(shù)，LMT均能代表同類的診斷液，所以直接兩相滴定法可作為奶牛隱性乳房炎診斷液的含量測定方法。

奶牛隱性乳房炎診斷液；陰離子活性物；表面活性劑；含量測定

奶牛乳房炎是一種影響奶牛業(yè)發(fā)展的常見普通病，尤其是隱性乳房炎，發(fā)病率極高[1-3]，我國奶牛隱性乳房炎的平均頭發(fā)病率在50%左右[4-5]。隱性乳房炎可降低奶產(chǎn)量，使奶牛的年生產(chǎn)能力降低10 %左右；降低乳品質(zhì)量，使乳汁中氨基酸總量降低21%左右；致使乳汁中病原微生物的檢出率明顯升高[6-8]，危害消費者身體健康。由于患隱性乳房炎的乳房和乳汁均無肉眼可觀察到的病理變化，臨床上常被忽視，不僅造成乳產(chǎn)量和質(zhì)量的下降，而且造成致病菌的擴散和傳播，危害極大[9-10]。對于奶牛隱性乳房炎的防控，國內(nèi)外均主張采用常規(guī)診斷與綜合防治相結(jié)合的防控措施[11-13]。目前臨床常用的奶牛隱性乳房炎診斷液，是一種以陰離子表面活性劑為主要成份的體外診斷試劑[14]。對于體外診斷試劑，歐美及我國衛(wèi)生部均將其納入醫(yī)療器械管理范圍，但我國的獸用醫(yī)療器械還沒有實施有效的管理制度[15]，因此奶牛隱性乳房炎診斷液尚無有效的管理辦法和質(zhì)量、技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，不僅影響了診斷液的市場發(fā)展，也妨礙了奶牛隱性乳房炎防控措施的有效實施。目前，國內(nèi)外常見的奶牛隱性乳房炎診斷液CMT、LMT、BMT等，其主要成份均是以十二烷基硫酸鈉（SDS）和十二烷基苯磺酸鈉（LAS）為主的陰離子表面活性劑。本試驗以陰離子活性物含量測定為重點，開展奶牛隱性乳房炎診斷液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，為規(guī)范診斷液的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑。三氯甲烷、硫酸、氫氧化鈉、95%乙醇為國產(chǎn)分析純試劑。十二烷基硫酸鈉（≥99%）、氯化芐蘇鎓（海明1622，≥99%）、溴化底米鎓（95%）、酸性藍(lán)-1（=50%）為Sigma產(chǎn)品；分析中使用的水均為蒸餾水。

1.1.2 試樣。十二烷基硫酸鈉（SDS，上海白貓股份有限公司生產(chǎn)，陰離子活性物含量≥90%）；十二烷基苯磺酸鈉（LAS，江蘇清婷洗滌品有限公司生產(chǎn)，陰離子活性物含量≥90%）；乙氧基化烷基硫酸鈉（AES，臨沂綠森化工有限公司生產(chǎn)，陰離子活性物含量≥69%）；S+L+A（SDS、LAS、 AES的混合物，其摩爾比為1：1：1）；奶牛隱性乳房炎診斷液LMT（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所生產(chǎn)，陰離子活性物含量為0.8 mol/L）。

1.2 方法[16]

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液及指示劑。按照 GB/T 5173-1995（表面活性劑和洗滌劑/陰離子活性物的測定-直接兩相滴定法），制備0.004 mol/L氯化芐蘇鎓標(biāo)準(zhǔn)溶液和酸性混合指示劑。

1.2.2 直接兩相滴定法測定陰離子活性物含量。稱取陰離子活性物為4mmol的試樣，用適量水溶解，再用0.5mol/L的氫氧化鈉或硫酸溶液調(diào)pH在7.5～9.5之間，然后用水稀釋至1000mL，使陰離子活性物含量約為0.004mol/L，準(zhǔn)確移取25mL于具塞三角燒瓶中，加入10mL水，15mL氯仿和10mL酸性混合指示劑，用0.004 mol/L氯化芐蘇鎓標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點。滴定過程充分震搖，滴至乳狀液破乳，三氯甲烷層紅色退去，變?yōu)闇\灰藍(lán)色。1mL 0.004 mol/L陰離子活性物相當(dāng)于1mL 0.004 mol/L氯化芐蘇鎓。

1.3 方法評價[17]

1.3.1 準(zhǔn)確度。以LMT為例，進行方法評價。制備陰離子活性物含量分別為0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L的LMT試樣，作為真值，每個含量的試樣各取3份，按1.2.2的方法測定陰離子活性物含量，作為測定值，計算相對誤差（RE）。

1.3.2 精密度。在一個工作日內(nèi)，按1.3.1的方法，制備LMT試樣及測定陰離子活性物含量，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，進行日內(nèi)分析；連續(xù)5個工作日，每個工作日分別按上法制備LMT試樣及測定陰離子活性物含量，計算日間RSD，進行日間分析。專屬性制備不含陰離子活性物的LMT空白試樣，測定陰離子活性物含量。

2 結(jié)果

2.1 試樣中的陰離子活性物含量

采用直接兩相滴定法，測定SDS、LAS、AES、S+L+A及LMT的陰離子活性物含量，結(jié)果見表1。計算過程中，SDS、LAS和AES的分子量采用平均相對分子量（依照國標(biāo)法 GB/T 13530.3計算）。每個試樣制備5份（n=5），分析結(jié)果的

相對誤差RE在-2.37%～2.50%范圍內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD在0.63%～3.87%范圍內(nèi)。

表1試樣中的陰離子活性物含量

2.2 方法的準(zhǔn)確度及精密度

直接兩相滴定法測定LMT中的陰離子活性物，準(zhǔn)確度和精密度分析結(jié)果見表2和表3。表示準(zhǔn)確度的RE值為-0.86（-3.88～3.06%）。表示精密度的日內(nèi)RSD為0.57～3.14%，日間RSD為2.19%。專屬性試驗結(jié)果顯示，不含陰離子表面活性劑的LMT試樣，檢測不到陰離子活性物，說明LMT中的輔料成分對測定結(jié)果沒有影響。因此，本方法測定LMT及其相關(guān)的陰離子表面活性劑具備必要的準(zhǔn)確度、精密度和專屬性。

表2方法的準(zhǔn)確度

表3方法的精密度

3 討論

奶牛隱性乳房炎診斷液中的主要成分是以SDS和LAS為主的陰離子表面活性劑。研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛隱性乳房炎診斷液中可以使用的陰離子表面活性劑選擇范圍較廣，除了SDS和LAS，還可以使用AES、LASH等，并且混合使用也不影響診斷液的診斷結(jié)果。本試驗的結(jié)果顯示，直接兩相滴定法測定陰離子表面活性劑的范圍較廣，不僅可以測定SDS、LAS、AES等，還可以測定它們的混合物S+L+A，因此非常適合奶牛隱性乳房炎診斷液中陰離子活性物的含量測定。

目前全世界廣泛使用的奶牛隱性乳房炎診斷液是CMT，而LMT是參考CMT技術(shù)研發(fā)的第一個國產(chǎn)診斷液，其它國產(chǎn)診斷液均是在CMT和LMT技術(shù)的基礎(chǔ)上開發(fā)的同類產(chǎn)品，無論是組成配方還是診斷方法，LMT均具有一定的代表性。因此，本實驗建立的直接兩相滴定法并不限于LMT的陰離子活性物含量測定，也可以用于同類診斷液的含量測定。

與一般化合物含量測定概念不同的是，陰離子表面活性劑多為混合結(jié)構(gòu)，因此，用于奶牛隱性乳房炎診斷液中陰離子活性物的含量測定方法，其靈敏度并不是越高越好，而是在一定的范圍內(nèi)才能客觀反映診斷液質(zhì)量。陰離子表面活性劑（陰離子活性物）含量測定方法的報道很多[18]，但通過對高效液相色譜法、季銨鹽-溴甲酚紫分光光度法和直接兩相滴定法進行對比試驗，發(fā)現(xiàn)高效液相色譜法的靈敏度較高，不適合用于診斷液的含量測定，季銨鹽-溴甲酚紫分光光度法影響因素很多，很難掌控合適的測試條件，而直接兩相滴定法測定奶牛隱性乳房炎診斷液的代表產(chǎn)品LMT，具備必要的準(zhǔn)確度、精密度和專屬性，因此不僅適合作為LMT的含量測定方法，也適合作為同類診斷液的含量測定方法。

隨著我國奶牛業(yè)的發(fā)展和乳品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高，奶牛乳房炎的防控顯得越來越重要，而乳房炎診斷液在乳房炎防控中發(fā)揮著非常重要的作用。由于目前奶牛隱性乳房炎診斷液尚無有效的管理辦

法，因此開展質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，不僅有助于診斷液的市場化發(fā)展，而且有利于進一步規(guī)范診斷液的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。

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Content Determination of Anionic Active Matter in Diagnostic Reagent for Subclinical Mastitis in Dairy Cow

Li Xinpu，Luo Jinyin，Li Hongsheng，Yang Feng

（Key Laboratory of New Animal Drug Project，Gansu Province / Key Laboratory of Veterinary Pharmaceutical Development，Ministry of Agriculture / Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Pharmaceutical Sciences of CAAS，Lanzhou 730050）

ObjectiveThe quality standard of diagnostic reagent for subclinical mastitis in dairy cow was studied，with particular emphasis on content determination in order to regulate the technology standard of the diagnostic reagents.MethodDirect two-phase titration method was developed to determinate the anionic active matter in diagnostic reagents for subclinical mastitis in dairy cow. Taking the diagnostic reagent LMT as an example，its accuracy，precision and specificity were evaluated.ResultAccuracy analysis showed that the RE was -0.86%（-3.88～3.06%）. Precision analysis showed that intra-day RSD and inter-day RSD were 0.57～3.14% and 2.19% respectively. Specif city analysis showed that the result was not affected by other accessory ingredients in LMT. Direct two-phase titration method was developed to determine anionic active matter in LMT with necessary accuracy，precision and specif city.ConclusionBecause LMT is representative both in composition and technology in diagnostic reagents for subclinical mastitis in dairy cows，so direct two-phase titration method could be used to content determination of the diagnostic reagents.

diagnostic reagent for subclinical mastitis in dairy cow； anionic active matter； surfactant； content determination.

S858.23

：B

：1005-944X（2014）10-0062-04

農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定項目“奶牛隱性乳房炎快速診斷技術(shù)”（2012-285）；“十二五”國家科技支撐計劃（2012BAD12B03）；甘肅省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項目（GNCX-2013-59）；甘肅省自然科學(xué)基金項目（1308RJZA119）

李新圃